狂犬病病毒G蛋白的克隆表达及其V区特异性单克隆抗体的制备与鉴定
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的致死性神经紊乱传染病。RV基因组为单股负链RNA，其具有五种结构蛋白，分别是N蛋白，P蛋白，M蛋白，G蛋白和L蛋白。在五种结构蛋白中，G蛋白在病毒结构蛋白中具有重要地位，它存在于病毒表面，既是病毒的主要保护性抗原，又在病毒侵染宿主造成神经系统疾病中具有重要作用，与病毒感染性直接相关。 本研究根据RV弱毒型LBNSE株G基因全序列，成功构建了原核表达载体pET-30a-G，用于完整表达RVG蛋白。重组表达质粒pET-30a-G转化入大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，利用IPTG诱导，并采用SDS-PAGE和Western blot两种方法对其表达性进行分析，结果一致性的在蛋白分子量67 KDa附近出现了蛋白大量表达的条带，表明构建的pET-30a-G重组质粒正确表达G蛋白，大约为67 KDa，并且具有相应的蛋白反应原性，可用于后续研究提供研究基础。 同时，本研究进一步对RV弱毒型LBNSE株与野生型IMDRV-13株的G蛋白进行真核表达，并成功构建了两种不同真核表达载体pCAGGS-G/pCAGGS-13G。利用免疫荧光与RT-PCR的方法鉴定重组质粒的表达情况，结果免疫荧光出现了特异性的荧光信号，RT-PCR鉴定出现了特异性的条带，表明构建的两种真核重组表达质粒具有正确表达G蛋白的能力。该研究成果可用于后续研究中鉴定McAb的识别位点提供研究基础，并将为进一步揭示RVG蛋白生物学功能提供研究基础。 为制备RVG蛋白特异性单克隆抗体(McAb)及鉴定其识别范围，本研究采用人工合成多肽“PPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEE”与KLH的偶联物免疫小鼠，经筛选制备出一株阳性杂交瘤细胞，记作4D3，其亚类鉴定为IgG2b/κ链。利用构建好的表达载体pCAGGS-G/pCAGGS-13G鉴定McAb的结合范围。免疫荧光与Western blot分析显示:该株McAb与真核表达的人工减毒株LBNSE G蛋白可发生特异反应，而与强毒株IMDRV-13 G蛋白不反应。将免疫用多肽序列、毒株LBNSE相应序列和强毒株IMDRV-13相应序列相互比较，G蛋白的第264位氨基酸的改变直接影响该株McAb的结合，由于261位至264位氨基酸构成G蛋白V区线性表位，可推测该株McAb可识别G蛋白V区线性表位。本试验结果可为进一步研究G蛋白的结构、功能和毒株的初步筛查提供参考，为控制和消灭狂犬病做出相应贡献。 本实验室也设计了其他多肽序列的组合，正在进行单抗的制备，以期获得全覆盖的抗体组合，为狂犬病毒的基础研究和检测技术研究提供可靠的工具抗体。
狂犬病病毒;G蛋白;克隆表达;单克隆抗体
中国农业科学院
硕士
兽医
温永俊
2017
中文
R373.9
54
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）