血红蛋白β亚基对RHDV复制的影响
兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)是杯状病毒科兔病毒属的一个成员，能够引起成年家兔的兔病毒性出血症，俗称“兔瘟”。兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种急性、败血性高度致死性传染病，死亡率高达100％，对养兔业具有毁灭性打击。因为缺少合适的细胞培养系统，目前对RHDV的分子生物学研究很落后，特别是对兔病毒性出血症病毒的分子致病机理的认识仍然较少，所以有必要加强对该病毒的分子生物学基础研究。 RHDV基因组长约7.5kb，含有两个开放阅读框(open reading frame，ORF)，ORF1和ORF2，ORF1编码一个大小约为257 kDa多聚蛋白，该多聚蛋白又被裂解为7个非结构蛋白和1个结构蛋白(VP60)，ORF2编码次级结构蛋白(VP10)。本实验室前期工作发现:兔病毒性出血症病毒的VPg蛋白能够与宿主的翻译起始因子帽子结合蛋白eIF4E(eukaryotic initiation factor4E)互作，这种相互作用是RHDV翻译起始所需要的;VP60是兔瘟病毒的衣壳蛋白，含有579个氨基酸，相对分子质量为60 kDa。VP60在病毒的感染、复制和免疫过程中占有重要地位。由于该病毒一直缺乏有效的体外增殖细胞系，有关RHDV的分子致病机理研究进展十分缓慢，对于其与宿主之间的相互作用研究的更少。鉴于此，本论文拟筛选与病毒衣壳蛋白相互作用的宿主因子，并研究它们之间的互作对病毒复制的影响，以期为研究RHDV的感染及致病机理提供重要线索。本论文开展的研究内容主要包括以下三个方面。 (1)利用CRISPR/Cas9技术构建了含血红蛋白β亚基的sgRNA的PX459-sgRNA重组质粒，并转染RK-13细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性克隆，并提取细胞基因组DNA，设计引物对sgRNA靶点邻近位点约500bp的基因组DNA片段进行PCR扩增，并通过测序鉴定以及WB验证，结果表明成功建立了稳定敲除HB的RK-13细胞系，并命名为RK-△HB细胞。本工作能够为研究HB在病毒生命进程中的作用提供研究平台。 (2)为了检测生物样品中的RHDV的含量，我们建立了基于SYBR Green能够实时检测RHDV复制水平的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的RHDV和RHDV2 VP60基因保守区序列设计一对特异性引物进行qPCR扩增;RHDV和RHDV2熔解温度分别为（86.3±0.1）℃和（85.1±0.1）℃，并且只观察到一个特异性峰。这些结果显示该方法不仅能够灵敏、准确特异地检测RHDV的复制，而且结合熔解曲线分析该方法也能够快速地鉴别RHDV和RHDV2。 (3)我们利用CO-IP技术筛选出了与VP60相互作用的宿主蛋白，其中包含HB蛋白。我们对HB蛋白进行进一步研究。利用免疫共沉淀、GST pull down、亚细胞定位实验证实了VP60和HB两者存在相互作用，并且存在共定位现象。我们也发现在RK-13细胞中过表达HB基因能够抑制RHDV复制过程，而敲除HB基因的细胞系中RHDV复制水平得到促进。 综上所述，本论文首次用实验证明血红蛋白B亚基能够与RHDV VP60蛋白相互作用，这种相互作用对RHDV的复制具有一定的抑制作用，缺失RK-13细胞中HB的表达，RHDV的复制水平得到提高。该研究结果为进一步研究RHDV的致病机制以及病原与宿主的互作提供了线索。
兔出血症病毒;致病机理;血红蛋白β亚基;病毒复制
中国农业科学院
硕士
预防兽医学
刘光清
2017
中文
S852.65;S858.291
57
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）