鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定及Epitope-ELISA诊断方法的建立
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)引起的一种急性传染病，该种疾病主要能够引起蛋鸭产蛋量骤然下降、采食量减少、体重下降等症状，同时出现卵巢充血、出血、萎缩、坏死等病理变化，这给我国鸭养殖业造成了巨大的经济损失。由于鸭坦布苏病毒病是一种新发传染病，以往的研究主要集中在生物学特性上，而对抗原表位的研究甚少，因此，本实验利用噬菌体展示技术进行DTMUV E蛋白抗原表位的鉴定，以便能够更深入了解病毒的抗原结构。 本研究以纯化的三株抗DTMUVE蛋白单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb)1F3、3B6和1A5为固相筛选分子，按照结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体随机12肽库，确定出DTMUVE蛋白模拟表位的氨基酸序列。设计合成针对表位的寡核苷酸序列，并与GST蛋白进行融合表达，通过Western-Blot分析，最终成功鉴定出DTMUV E蛋白的三个最小线性抗原表位221LNLPW226，374EVEPPFG380和87YAEYI91。将筛选到的三个最小线性表位与DTMUV不同毒株的E蛋白序列进行比对，结果显示鉴定出的三个最小抗原表位LNLPW，EVEPPFG和YAEYI在DTMUV中具有高度的保守性，无氨基酸位点的差异，且通过对DTMUV E蛋白三维结构模拟分析发现表位LNLPW和YAEYI位于E蛋白结构域Ⅱ，表位EVEPPFG位于E蛋白结构域Ⅲ，这对于了解DTMUV E蛋白抗原空间结构及功能具有重要意义。 将抗原表位与登革热病毒(Dengue virus，DENV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)的E蛋白序列进行比对，结果表明表位序列LxLPW与ExEPPFG在几种病毒中高度保守，而表位序列YAEYI与这些病毒没有同源性。Dot-Blotting结果显示表位肽段LxLPW和ExEPPFG与DENV、JEV、WNV、ZIKV阳性血清均发生交叉反应，而表位肽段YAEYI则不具有交叉反应性，表明表位序列LxLPW与ExEPPFG为几种黄病毒所共有的线性抗原表位，而表位序列YAEYI为DTMUV所特有的抗原表位。利用DTMUV特异性抗原表位YAEYI建立Epitope-ELISA血清学诊断方法对鸭血清样品进行检测，并且以中和试验做为标准进行比较，结果显示Epitope-ELISA检测方法的特异性为100％，敏感度为96％，并且Epitope-ELISA与其他黄病毒血清间不出现交叉反应，表明本研究建立的Epitope-ELISA检测方法是一种特异的、灵敏的ELISA血清学诊断方法，这对于鸭坦布苏病毒感染的临床诊断和抗体水平的评价等具有重要意义。
鸭坦布苏病毒;E蛋白;抗原表位;Epitope法;ELISA法
中国农业科学院
硕士
预防兽医学
张云
2017
中文
S858.32
59
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）