兔出血症病毒特异性核酸适配体的筛选
兔出血症(Rabbit haemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic diseasevirus，RHDV)引起的成年兔的一种急性、致死性、接触性传染病，给兔养殖业带来巨大损失。RHD的抗原检测方法包括:人“O”型血红细胞凝集试验(HA)，该方法有时会产生假阳性或假阴性;电镜法，对设备要求较高;反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)灵敏度高，但相对耗时;琼脂扩散试验、双抗体ELISA、Western blot、原位杂交等都需要制备抗体，成本较高。 适配体自上世纪九十年代被提出发展至今，二十多年的时间里，在治疗和诊断方面的潜力已经逐步显现。适配体相对于抗体有许多优势:易于合成、可批量生产、一致性好、成本低、免疫原性低、可反复变性复性使用、易保存运输等，因此核酸适配体被广泛应用于生命科学的研究、靶点鉴定、肿瘤的靶向治疗、药物筛选、环境监测等各个领域。 从文库中将靶分子的特异性核酸适配体筛选出的方法称为SELEX技术，利用该技术已经成功筛选到艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus.，HIV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis virus，HBV)、流感病毒(Avain influenza.，AI)等多种病毒的核酸适配体，目前还没有关于RHDV病毒粒子特异性核酸适配体的报道。为筛选特异性好、灵敏度高的RHDV特异性核酸适配体，本研究在体外合成了一个长为80 nt的随机寡核苷酸文库(ssDNA)，其两端为固定序列，长度分别为20 nt，中间为随机序列，长度为40 nt，以RHDV衣壳蛋白VP60为靶分子，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜的方法将VP60蛋白纯化并固定在PVDF膜上，将消减的SELEX技术与Western blot方法相结合，并反复筛选至第20轮，以生物素标记的ssDNA文库为“一抗”，鉴定次级文库对膜上靶分子的特异性。结果表明，第20轮次级文库中含有能够特异性识别靶分子的适配体，将第20轮次级文库连接到pMD18-T载体，转化，并克隆测序，并以测序呈阳性的46个克隆为模板生成生物素标记的适配体，用这些适配体鉴定膜上的靶分子。结果发现，有三条适配体能够识别靶分子，且不识别膜上RHDV病毒粒子的其它蛋白，健康兔的肝组织蛋白和BSA蛋白，说明这三条适配体对靶分子具有特异性和亲和性。通过对适配体随机序列区的碱基成分分析，发现这三条适配体中鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的含量占了随机序列区的70％以上，我们预测这些碱基可能是对靶分子有特异性的适配体的保守序列的重要成分。通过mfold网站(http://unafold.rna.albany.edu/ q=mfold)对适配体二级结构的分析，发现这三条适配体均含有茎环结构，我们推测该结构是适配体识别靶分子VP60蛋白的基本结构。 本研究通过将传统的SELEX技术和Western blot方法结合，摸索了特异性适配体的筛选条件，得到了对靶蛋白VP60有特异性和亲和性的富集文库。筛选到三条对靶分子VP60蛋白有特异性和亲和性的适配体，分析预测了这三条适配体的二级结构。为建立新的RHD诊断和治疗方法奠定了基础。
兔出血症病毒;核酸适配体;SELEX技术
中国农业科学院
硕士
兽医
刘家森
2017
中文
S852.65
50
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）