链霉素药渣危害因子确证及其诱导细菌耐药机制研究
链霉素药渣是生物发酵生产链霉素过程中产生的工业废弃物，其含有一定浓度的粗蛋白和未被完全提取的链霉素，并且含有危害尚不明确的次级代谢产物，若将其饲喂动物存在食品安全隐患和诱导细菌耐药性风险。目前，国内外尚未开展链霉素药渣危害因子分析和诱导细菌耐药性的风险评估，而且尚无饲料中链霉素药渣确证分析方法。为了有助于实现有效的“事后监管”和充分的“事前预警”，本研究开展了链霉素药渣危害因子识别、饲料中链霉素药渣确证分析方法开发、危害因子诱导细菌耐药性风险分析及诱导细菌产生耐药的机制研究。具体研究内容和结果如下: 1.链霉素药渣危害因子识别。将链霉素及其生物合成中间产物（共25种）作为危害因子靶向筛查范围，采用3种溶剂(高水相、高有机相、低pH)提取药渣中代谢物，2种色谱（反向、亲水）模式保留后分离，正、负电离（ESI±）模式电离，高分辨质谱在m/z:50-1200Da范围内检测代谢物组，发现并确认药渣中含有链霉胍和链霉素2种化合物。通过危害分析，发现链霉胍和链霉素存在动物食品蓄积毒性和诱导细菌耐药风险。因此，将其确定为链霉素药渣危害因子。 2.将链霉胍、链霉素作为链霉素药渣特征标志物，建立了饲料中链霉素药渣确证分析方法。该方法以20％TCA溶液为提取溶剂，采用Na2EDTA消除基质中金属离子干扰，通过弱阳离子交换固相萃取(WCX)方式净化、富集目标化合物，利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)正离子(ESI+)电离、多反应监测(MRM)模式检测2种特征标志物。方法准确性（链霉素:71％-78％,链霉胍:75％-84％）、精密度(5.4％-9.6％)、线性范围（50-1000μg/kg范围内R2≥0.99）、LODs(20μg/kg)、LOQs（50μg/kg）等性能指标能够满足饲料中链霉素药渣确证分析要求。 3.链霉素药渣危害因子诱导细菌耐药性风险分析。以大肠杆菌（E.Coli）、沙门氏菌(Salmonella)为受试菌，链霉胍、链霉素为诱导因子，开展了体外诱导耐药性风险分析。结果表明，链霉素能够诱导2种受试菌产生耐药性;链霉胍不能诱导2种受试菌产生链霉素耐药性，但是与链霉素同时存在条件下对E.Coli具有协同诱导耐药的作用。该结果从体外实验的角度表明链霉素药渣危害因子存在诱导细菌产生耐药性的风险，并且大于相同浓度链霉素的诱导耐药风险。 4.采用非靶向代谢组学方法研究链霉素、链霉胍诱导E.Coli耐药机制。建立了E.Coli代谢组学样品前处理方法，即低温生理盐水熔灭，冷冻研磨-超声裂解细胞、冷甲醇-水(50/50, v/v)提取代谢物组。采用该方法对链霉素耐药E.Coli进行样品前处理，通过UPLC-QTOF对代谢物进行分离和测定，经PCA、OPLS-DA分析以及Chemspider等在线数据库比对方式筛选、鉴定出不同诱导方式诱导获得的耐药菌株与敏感菌株差异代谢物22种。经过KEGG代谢通路分析和MetaboAnalyst代谢通路拓扑分析，发现谷胱甘肽代谢、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解、丙酮酸代谢、丁酸代谢、脂肪酸代谢、丙酸酯代谢、泛酸和辅酶A生物合成、甘油磷脂代谢途径直接或间接介导E.Coli链霉素耐药，甘油磷脂代谢与链霉胍协同诱导耐药作用相关。
链霉素药渣;危害因子;细菌耐药;饲料检测
中国农业科学院
博士
农产品质量与食物安全
石波
2017
中文
S816
122
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）