鸭疫里默氏杆菌脂多糖合成相关基因的鉴定及生物学特性分析
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是一种可感染雏鸭、鹅、火鸡等禽类后产生全身性败血症的重要致病菌。本病具有高发病率和高死亡率，广泛分布于世界各地，给养鸭业造成巨大的经济损失。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分之一，同时在大多数革兰氏阴性菌中是一种重要的毒力因子，能够影响细菌的致病力。本研究用RA脂多糖单克隆抗体对RA血清1型转座子随机突变库进行筛选，获得2株LPS突变株，生物学特性分析和动物免疫保护试验结果表明LPS O-抗原缺失后不仅会导致RA的致病力明显下降，而且还会使RALPS突变株具有一定的交叉保护力。本研究包括以下2部分内容: 一、本研究中，运用间接ELISA方法筛选RA血清1型CH3菌株Tn4351转座子随机突变库，试验结果表明有两株突变株与RALPS单抗8A9均呈阴性反应，分别命名为RA1067和RA1062。Southern-blot验证突变株RA1067基因组中只有一个转座子插入，序列分析显示转座子插入基因是M949_RS01915基因。qRT-PCR检测M949_RS01915上下游基因的转录水平，结果显示转座子插入不影响M949_RS01915上下游基因的转录水平，表明是M949_RS01915基因的失活导致突变株RA1067的生物学特性改变。通过测定该突变株LD50和血液载菌量，结果表明RA1067毒力较野生株CH3显著下降，且易被机体所清除。血清杀菌试验证明RA1067对健康鸭血清的敏感性明显增强。转录组测序结果显示，与野生株相比，RA1067共有19个差异表达基因，且差异表达倍数均大于5倍。qRT-PCR进一步验证有2个基因上调大于3倍，3个基因下调大于3倍，功能分析结果表明上调基因主要参与新陈代谢和生物负调节过程，下调基因主要涉及新陈代谢和催化活性作用，其中编码荚膜多糖合成蛋白CapD的M949_RS07580基因下调50倍，可能与荚膜多糖和脂多糖O-抗原合成相关。免疫实验结果表明，RA1067突变株灭活疫苗可以有效保护血清1型W J4、血清2型Yb2、血清10型HXb2的攻毒，因此RA1067可以作为一株有交叉免疫保护的疫苗候选株。以上结果表明M949_RS01915基因参与鸭疫里默氏杆菌脂多糖O-抗原合成和基因的调节作用，且与致病性相关。 二、本研究中，根据之前间接ELISA试验的研究结果，获得突变株RA1062。Southern-blot验证突变株RA1062基因组中只有一个转座子插入，对其鉴定后发现突变基因是编码CPBP proteasefamily protein的M949_RS01035基因。序列分析结果显示该基因为RA血清1型和10型菌株所特有。Western-blotting试验结果表明RA1062 LPS与CH3相比，O-抗原部分的梯状条带明显缺失。同时RA1062对雏鸭的致病力显著下降、对血清的抵抗力也更为敏感。另外，我们同时制备RA1062灭活疫苗并进行了疫苗的免疫效果评估试验，结果表明樱桃谷鸭经过二次RA1062灭活疫苗免疫后对血清1型(WJ4)、和血清10型(HXb2)强毒攻击产生100％的保护率，对血清2型(Yb2)强毒攻击的保护率也可达到75％。转录组测序结果显示，与野生株相比，突变株有12个基因上调表达，9个基因下调表达。qRT-PCR进一步验证有2个基因上调表达大于5倍，2个基因下调表达大于5倍，其中两个上调基因M949_RS07300、M949_RS04680和一个下调基因M949_ RS03025编码的蛋白都是TonB-dependent receptor蛋白。其中编码荚膜多糖合成蛋白CapD的M949_RS07580基因下调50倍，可能与荚膜多糖和脂多糖O-抗原合成相关。以上结果表明M949_RS01035基因参与鸭疫里默氏杆菌脂多糖O-抗原合成和基因的表达调控，且与致病性相关。
鸭疫里默氏杆菌;脂多糖;O-抗原;转录组;疫苗候选株
中国农业科学院
硕士
预防兽医学
于圣青
2017
中文
S852.61
67
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）