食源性棕榈酸诱导斑马鱼肝脏脂毒性反应研究
棕榈油，产量仅次于大豆油，已广泛应用于鱼类饲料中。棕桐油富含棕榈酸，而细胞内过量的棕榈酸积累会引起细胞功能紊乱或者细胞死亡，即脂毒性。在哺乳动物细胞模型中，高浓度棕榈酸(250-500μM)会诱导内质网应激和凋亡，然而棕榈酸脂毒性在暖水鱼活体及细胞水平上还未见报道。 本研究的第一部分利用斑马鱼建立暖水鱼的棕榈酸养殖模型，向斑马鱼投喂低脂(LF)，高脂(HF)以及3种添加了棕榈酸的高脂饲料(PA4％，PA8％，PA12％)，饲喂2周检测肝脏棕榈酸积累情况，饲喂4周检测血清ALT、血清AST、肝脏ALT、肝脏AST、肝脏caspase-3以及Trx和Saa2 mRNA水平，作为肝脏损伤指标;检测Grp78和Chop mRNA水平，并且通过免疫组化检测肝脏GRP78和CHOP蛋白水平，作为内质网应激指标。结果显示，肝脏棕榈酸含量随饲料中含量的升高而升高;与HF组相比，PA8％和PA12％组血清ALT水平分别升高了40.7％和59.5％，血清AST水平分别升高了28.8％和28.0％;与HF组相比，PA12％组Grp78和Chop mRNA分别增加至2.2和2.7倍，食源性棕榈酸诱导斑马鱼肝脏损伤和内质网应激。 本研究第二部建立棕榈酸-细胞模型，研究暖水鱼肝脏对棕榈酸脂毒性的反应机制。该部分利用RTCA实时监控系统，Alarmablue活性检测试剂检测斑马鱼肝脏细胞活性，利用流式细胞仪检测棕榈酸对斑马鱼肝脏细胞凋亡的影响，利用qPCR检测未折叠蛋白应答反应通路激活情况，并且用特异性抑制剂阻断通路激活，验证该通路与棕榈酸脂毒性的联系。结果表明，与对照组相比，棕榈酸抑制斑马鱼肝脏细胞活性，诱导斑马鱼肝脏细胞凋亡，且未折叠蛋白应答反应感应因子Grp78和Grp94 mRNA均受到棕榈酸显著性上调。阻断PERK-CHOP和IRE1αt-JNK通路缓解棕榈酸诱导的凋亡，阻断ATF6通路加剧棕榈酸诱导的凋亡。该部分结果表明，PERK-CHOP和IRE1α-JNK通路参与棕榈酸对斑马鱼肝脏细胞的脂毒性。 本研究第三部分利用斑马鱼幼鱼验证棕榈酸对斑马鱼肝脏的脂毒性反应通路，向5-dpf幼鱼投喂LF，HF，PA8％饲料，投喂1周，利用qPCR检测内质网应激诱导情况及未折叠蛋白应答反应通路，并且根据检测结果选择特异性内质网应激抑制剂阻断PERK-CHOP和ATF6通路。结果显示，与HF组相比，PA8％组幼鱼的Trx和Saa2均受到显著性上调，Grp78、Grp94、Perk、ChopmRNA水平均较HF显著升高，PA8％组幼鱼自噬基因Bec1、Atg4b、Atg9a mRNA水平也受到上调;抑制剂试验结果表明，与对照组(DMSO)相比，salubrinal有效抑制PA8％组幼鱼PERK-CHOP通路基因表达，AEBSF有效抑制ATF6通路基因表达，salubrinal同时还下调了PA8％组幼鱼自噬基因Bec1、Atg4b、Atg9a，肝脏损伤基因Saa2 mRNA水平。该部分结果表明，食源性棕榈酸通过PERK-CHOP促凋亡通路诱导肝脏损伤。 通过研究食源性棕榈酸对斑马鱼肝脏的负面影响，我们发现棕榈酸通过内质网应激激活的促凋亡通路诱导肝脏细胞损伤，也阐明了棕榈油中的高棕榈酸含量会成为棕榈油在暖水鱼养殖中应用的限制性因素。
棕榈酸;动物模型;肝脏脂毒性;内质网应激;细胞凋亡
中国农业科学院
硕士
动物营养与饲料科学
周志刚;徐俐
2017
中文
S963;S965
68
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）