猪流行性腹泻病毒S基因在昆虫细胞中的表达及其单克隆抗体的制备
猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起哺乳仔猪的急性水样腹泻、呕吐和脱水等症状，在新生仔猪中发病率和致死率较高。2010年变异的猪流行性腹泻病毒袭击了我国大部分地区，造成了猪流行性腹泻(PED)疫情的大面积爆发和流行，对养猪产业造成巨大的经济损失。为了探究该病原的流行病学和病原学特点，我们从北京、上海、浙江、河南、山东等5个省市不同发病猪场采集了77份腹泻样品，以实验室已建立的RT-PCR方法进行PEDV鉴定，结果显示PEDV阳性率达74.0％。分别从不同地区发病猪场选取部分阳性样品进行S基因的克隆和测序，并将其与国内外具有代表性的参考株S基因进行序列比对和遗传变异分析。核苷酸序列比对结果显示，本研究获得的S基因与流行株同源性达97.1％～99.4％，而与经典株的同源性则在93.9％～94.3％之间。氨基酸序列比对结果表明:与经典株相比，其S蛋白存在氨基酸插入（59QGVN62和N140）和缺失(163NI164/163DI164)的特征性突变;与流行株相比，除了一些散在氨基酸突变外，还存在2处特征性氨基酸突变，分别是182位(Y→H)和345位(F→L)。S基因的进化树分析显示，本研究所获得的S基因与流行毒株的S基因遗传距离较近，处于同一分支。结果表明本研究获得的PEDV毒株属于S基因存在明显变异的PEDV流行毒株，且2016～2017年流行的PEDV在2010年流行株的基础上其S基因又存在一些新的氨基酸突变。 为探究猪流行性腹泻病毒流行毒株S基因编码蛋白的抗原特性，本研究以PEDV流行毒株FJzz1/2011株的S蛋白为研究对象，根据S蛋白的切割位点设计合成特异性引物，通过RT-PCR扩增获得S1基因，将其克隆至转移载体pFastBacHTA中，获得了阳性重组质粒pFastBacHTA-S1，将阳性重组质粒转化于E.coli DH10Bac感受态细胞中，经蓝白斑筛选和PCR鉴定，获得了阳性重组穿梭质粒rBacmid-S1，提取重组穿梭质粒并转染于Sf9细胞，结果显示，Sf9细胞在转染48h后即可观察到明显的细胞病变，转染后72h收获重组病毒rBac-S1-P1，将收获的病毒在Sf9细胞上连续传3代，取P3代重组病毒感染Sf9细胞，72h后收获细胞进行IFA鉴定、SDS-PAGE电泳和western blot分析，结果显示，P3代重组病毒rBac-S1-P3感染的细胞呈现亮绿色荧光，证实其可以被抗PEDV阳性猪血清和抗S1蛋白的单抗所特异性识别。SDS-PAGE电泳结果显示在大约120kDa左右可观察到一条特异性目标条带。该目标条带经western blot鉴定证实其可以被抗S1蛋白的特异性单抗所识别。为了获得针对S蛋白的单克隆抗体，我们用超离纯化的PED病毒粒子免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤细胞融合技术，鉴定出8株可特异性识别PEDV感染的Vero细胞的单克隆抗体，进一步利用能够表达S1蛋白的重组病毒rBac-S1感染的Sf9细胞进行IFA筛选，最终获得了5株能特异性识别S1蛋白的单抗杂交瘤细胞株，本研究结果为今后继续深入研究PEDV S蛋白的抗原性奠定了基础。
猪流行性腹泻病毒;S蛋白;抗原性;单克隆抗体
中国农业科学院
硕士
兽医
周艳君
2017
中文
S852.65
66
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）