猪血清淀粉样蛋白3对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种严重危及养猪业的传染病，病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)。该病自20世纪80年代末爆发以来，给我国乃至全球养猪业的发展造成了重大损失。血清淀粉样蛋白3(Serum amyloid A3，SAA3)是干扰素诱导蛋白，也是机体感染的指标分子之一。但是，PRRSV感染过程中猪SAA3的变化及其对PRRSV复制的影响尚不清楚。为此，本研究分析了PRRSV感染中SAA3的变化以及对PRRSV复制的影响，以期为研究PRRSV感染机制提供帮助。 根据猪SAA3的全基因序列设计特异性扩增引物，扩增猪SAA3的开放阅读框区域。将扩增的基因的片段连接到Flag7.1空载体构建真核表达载体。将猪SAA3的氨基酸序列分别与人和小鼠的SAA家族序列进行比对，阐明猪SAA3蛋白的分子生物学特性和系统进化关系，并以此为依据合成猪SAA3抗原小肽，用于制备SAA3多克隆抗体。将合成的猪SAA3抗原小肽免疫兔制备多抗血清，并用ELISA方法检测多抗血清效价，利用Western-blot以及间接免疫荧光技术检测多抗血清的特异性和灵敏性。结果显示，制备的多抗血清可以特异性识别猪源的SAA3蛋白。 为了检测PRRSV感染过程中，PAM细胞以及猪各个组织中SAA3的RNA水平和蛋白水平的变化。将PRRSV感染PAM细胞，在不同时间点提取RNA，用相对荧光定量PCR的方法检测SAA3 mRNA的动态变化。将PRRSV感染30日龄SPF猪，收取各个组织，分别在RNA和蛋白水平检测SAA3的变化。结果显示，在PAM细胞中，接毒组在12小时以后，SAA3 mRNA水平明显高于对照组。在猪各个组织中，接毒组各组织SAA3 mRNA水平都有不同程度的升高，其中肺脏升高最为明显，约是对照组的200倍。Western-blot结果发现，接毒组的肺脏、肾脏等的SAA3蛋白水平明显高于对照组，说明PRRSV感染时SAA3在机体各组织的表达会产生明显差异。 为了研究猪SAA3蛋白对PRRSV感染的影响，利用过表达猪SAA3以及外源加入SAA蛋白的方法来检测SAA3对PRRSV复制的影响。荧光定量PCR结果显示，过表达猪SAA3能够显著提高PRRSV mRNA复制水平。TCID50的结果表明，猪SAA3表达组的PRRSV滴度显著高于空载体对照组。分析SAA对病毒感染阶段的影响发现，外源加入SAA蛋白能够促进病毒对宿主细胞的吸附作用。 综上所述，本研究对猪SAA3进行了克隆、表达和抗体制备，分析了PRRSV感染对猪SAA3表达的影响及其生物学意义，发现了PRRSV可上调猪SAA3表达，SAA3能够促进PRRSV病毒复制和宿主细胞的吸附。
猪呼吸与繁殖综合征病毒;SAA3蛋白;病毒复制
中国农业科学院
硕士
预防兽医学
马志永
2017
中文
S852.65
66
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）