口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位关键位点鉴定与缺失标记病毒构建
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，传播迅速、发病率高，对发病地区的政治和经济有着巨大负面影响。传统灭活疫苗的免疫接种是当前预防和控制FMD最为有效的手段，但免疫后难以与自然感染动物进行区分，致使我国FMD无法得到彻底地控制和净化，因此需要发展能够区分自然感染和疫苗免疫的FMD标记疫苗。为了发展复制性能优良的FMD标记病毒疫苗候选株，本论文进行了以下三部分的研究: 1.利用丙氨酸扫描的方法成功构建了含FMDV rvOZK/93-083B123蛋白以及其突变体的16个真核表达质粒(S1～S16)，转染BHK-21细胞，24h后对转染细胞用实验室前期筛选、保存的一株抗FMDV3B的单克隆抗体3B4B1进行间接免疫荧光和免疫印迹分析。结果显示除S12表达的3B突变蛋白消除了与单抗3B4B1的结合能力外，其余表达的3B突变蛋白均能与单抗3B4B1发生特异性结合，表明单抗3B4B1识别的FMDV3B蛋白关键氨基酸位于3B1和3B2的2PY-GP6中。 2.在已构建的FMDV疫苗株pOZK/93-08感染性克隆的基础上，针对3B1和3B2的2PY-GP6做了一系列突变修饰，构建了6株含3B蛋白不同突变的全长重组质粒，NotⅠ线化后分别转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞，共拯救到3株重组病毒。将重组病毒以及亲本毒株接种BHK-21细胞后，分别用单抗3B4B1进行间接免疫荧光和免疫印迹分析，结果显示含3B1和3B2突变(4AGP6→4TAA6)的重组病毒rvO/TAA完全消除了与单抗3B4B1的结合能力，而其余病毒均能与该单抗发生特异性结合。进一步分析重组病毒rvO/TAA和亲本病毒的一步生长曲线，蚀斑表型以及遗传稳定性，结果表明rvO/TAA具有与亲本病毒相似的复制能力和噬斑表型，3B12蛋白的突变(4AGP6→4TAA6)对病毒复制无明显影响;rvO/TAA经过20次细胞传代后，RT-PCR测序显示突变的氨基酸稳定存在。 3.成功构建含FMDV3B1和3B2突变(4AGP6→4TAA6)的3B蛋白原核表达质粒，在BL21细菌中诱导表达、纯化后，连同实验室保存的FMDV rvOZK/93-083B蛋白进行浓缩，并用单抗3B4B1进行免疫印迹分析，结果同样显示含3B1和3B2突变(4AGP6→4TAA6)的O/TAA-3B蛋白不能与单抗3B4B1发生特异结合，而未突变的OZK-3B蛋白能够与该单抗发生特异性结合，说明3B1和3B2的突变(4AGP6→4TAA6)取消了与单抗单抗3B4B1结合能力。另外经ISA201佐剂乳化后分别免疫豚鼠和小鼠制备血清，用实验室建立的3B阻断ELISA方法进行了初步检测分析，结果显示突变3B蛋白制备的多组血清阻断值偏高(PI＞50％)，推测其原因在于单抗识别位点的临近位置存在干扰表位，或是原核表达蛋白的免疫原性同真核存在差异，表明配套诊断方法仍待进一步完善。 综上，本研究成功鉴定了抗FMDV3B蛋白单抗3B4B1识别的关键氨基酸，并通过口蹄疫病毒的反向遗传操作技术，成功构建了一株与亲本病毒复制能力相似的重组标记病毒，该病毒的成功构建为未来FMD标记疫苗的发展提供了材料。
口蹄疫;标记疫苗;3B非结构蛋白;反向遗传操作技术
中国农业科学院
硕士
预防兽医学
刘在新
2017
中文
S855.3
52
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）