日本血吸虫囊泡膜蛋白2(SjVAMP2)的生物学功能初探
血吸虫病是由血吸虫感染引起的危害严重的人畜共患寄生虫病。虫卵是血吸虫病的主要致病因素，同时也是该病的传染源。血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间，这很大程度与其特异的体被结构有关。血吸虫的体被是一特殊的合胞体结构是虫体与宿主接触的直接界面，由表膜、基质和基膜三部分组成。血吸虫体被表膜是紧密的双单位膜结构，且不断地进行更新，有助于虫体逃避宿主的免疫攻击。血吸虫体被基质中的多膜囊结构通过与表膜的融合，进而帮助表膜形成或更新。膜融合的关键分子是SNARE(N-甲基马来酰胺敏感因子附着蛋白的膜受体)，通过囊泡膜上的v-SNARE与靶膜上的t-SNARE形成SNARE复合物，从而促进了两个膜的接近与融合。VAMP（囊泡膜蛋白），即v-SNARE，通过N端保守结构域与t-SNARE的N端聚合，级联放大了整个SNARE复合物形成过程的聚合反应，这一反应也是整个膜融合过程中的限速步骤。VAMP2是研究最早、最多的囊泡膜蛋白，在神经信号转导、激素释放、胰岛素依赖的葡萄糖转运等过程中均起着关键的作用。本实验室在前期的日本血吸虫体被蛋白质组学的研究中，鉴定到了VAMP2蛋白分子，本研究旨在探究日本血吸虫VAMP2(SjVAMP2)的生物学功能，为阐述日本血吸虫的生长发育机制积累知识，为该病的防控提供思路。 生物信息学分析表明，日本血吸虫SjVAMP2为单跨膜蛋白，属于囊泡膜蛋白家族的成员之一。该蛋白N端含有一螺旋卷曲的保守结构功能域(N-coiled coil domain)，C端含有一个血吸虫所特有的保守结构，有作为血吸虫病诊断抗原及药物靶点的潜在价值。本文首次克隆出SjVAMP2基因482bp的ORF序列。实时定量PCR分析表明SjVAMP2在各个检测的生长发育阶段虫体中均有表达，但在28d及42d虫体中的转录水平较高，14d和35d虫体转录水平次之，在42d雌虫中的表达量明显高于42d雄虫，可能与这些阶段虫体处于快速生长期或雌虫产卵的特殊发育阶段有关。此外，SjVAMP2的转录水平在40 mg/kg和200 mg/kg吡喹酮处理的虫体中随时间呈现不同的变化，暗示着SjVAMP2可能参与吡喹酮引起的虫体受损体被表膜的修复过程。构建了重组表达质粒pET-28a-SjVAMP2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出约为25 kDa的rSjVAMP2重组蛋白。用该重组蛋白三次免疫BALB/c小鼠制备的抗rSjVAMP2特异性多克隆抗体血清作为一抗，进行免疫组化及免疫电镜分析，结果显示SjVAMP2蛋白主要定位于虫体体被，且主要分布于表膜内陷处及基质中的扁平体和多膜囊等分泌小体中。 Western blotting分析结果表明SjVAMP2蛋白具有较好的免疫原性，用rSjVAMP2蛋白三次免疫小鼠，在两次独立的重复试验中，分别诱导小鼠产生了41.5％(P＜0.001)和27.3％(P＜0.05)的减虫率及36.8％(P＜0.01)和23.3％(P＜0.05)的肝脏减卵率。ELISA分析显示，第二次免疫之后，小鼠体内抗rSjVAMP2特异性IgG抗体水平急剧升高，可能与rSjVAMP2诱导的免疫保护力有关。此结果表明，rSjVAMP2重组蛋白具有作为候选疫苗分子的潜力。 利用RNA干扰技术探究SjVAMP2在日本血吸虫生长发育过程中的作用。实时定量PCR和Western blotting分析结果表明筛选到的SjVAMP2特异siRNA能够在转录水平和蛋白水平有效地抑制SjVAMP2的表达。SjVAMP2 siRNA干扰组虫体的存活率仅为空白对照组为69.7％(P＜0.01)，且干扰组雄虫变小(P＜0.01)，发育受阻。扫描电镜观察发现约62％干扰组雄虫的体被表膜形态发生了变化，表现为雄虫口腹吸盘间的表膜不同程度的脱落，乳突异常增大增多，中后部的褶嵴发生一定程度的融合。在透射电镜下观察发现，干扰组雌虫的体被变薄，且表膜凹陷内折不全;雄虫的体被中出现大量的空泡，实质组织溶解，体被下组织中也有空泡出现。在体被基质中发现了由7层膜结构包裹的大的多膜囊结构，可能与虫体表膜更新有关。此外，抑制SjVAMP2基因的表达导致SGTP1、SGTP4、SjIR1和SjIR2四个与葡萄糖吸收、转运相关基因转录水平的显著下降，且干扰组虫体在低糖培养基中培养4d和6d的葡萄糖摄取量分别下降33.2％(P＜0.001)和39.3％(P＜0.01)，雌虫产卵量下降43.8％(P＜0.01)。在两次独立的体内干扰实验中，SjVAMP2 siRNA分别诱导小鼠产生了32.8％(P＜0.05)，50.4％(P＜0.01)的减虫率和48.8％(P＜0.05)，40.0％(P＜0.05)的肝脏减卵率，且干扰组小鼠肝脏的肉芽肿，纤维化等病理现象明显较对照组轻。 进一步利用酵母双杂交技术筛选SjVAMP2的相互作用蛋白。将SjVAMP2基因ORF序列与pGBKT7载体DNA重组，构建了pGBKT7-SjVAMP2重组质粒，并转入Y187酵母菌中。检测结果表明，诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌株无自激活活性、无细胞毒性，且pGBKT7-SjVAMP2重组质粒能够在酵母菌中成功表达，说明该诱饵菌株可应用于筛库。用诱饵pGBKT7-SjVAMP2酵母菌与18d日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库菌共培养，于SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷型固体培养基上反复转接培养后，得到27个阳性克隆，去除重复克隆，测序分析得到了包括sytaxinl，Olfactory receptor4-like，Rab11在内的7个可能互作的蛋白分子。 综上，本研究首次对SjVAMP2进行了克隆、表达和特征性分析，动物实验表明该重组蛋白具有作为候选疫苗分子的潜力。RNA干扰实验发现，SjVAMP2与血吸虫体被结构的维持密切相关，同时在日本血吸虫葡萄糖摄取和雌虫产卵等过程中发挥着重要作用。利用酵母双杂交技术初步筛选出7个可能的互作蛋白。本研究为阐述SjVAMP2在日本血吸虫生长发育过程中的生物学功能积累了知识，为血吸虫病疫苗候选分子或新药物靶标的筛选提供了思路。
日本血吸虫;VAMP2蛋白;生物学功能;体被表膜;免疫原性;葡萄糖摄取
中国农业科学院
博士
预防兽医学
林矫矫
2017
中文
S852.735
104
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）