利用CRISPR/Cas9技术编辑淀粉合成基因Pullulan
水稻（Oryza.Sativa）是世界主要的粮食作物。水稻成熟种子中胚乳约占总质量的90％。胚乳细胞的发育状况直接决定着水稻的产量和品质。稻米胚乳垩白直接影响稻米外观品质、碾磨加工品质和蒸煮食味品质。因此研究胚乳发育进程及淀粉合成机理对于实现水稻的高产、优质具有重要的意义。利用CRISPR/Cas9技术对调控稻米脱支酶基因PUL定点编辑，获得了一套有重要育种价值的pul突变体。首先设计两个guide RNA(gRNA)靶位点，crispr-PUL-T1和crispr-PUL-T2以定点编辑PUL基因的外显子区域;然后，将这两个靶点分别构建在中间载体SK-gRNA上;最后，用一步法连接两个中间组装到线性化的最终载体pC1300 Cas9上。 1农杆菌转化及T0转基因植株突变验证 将构建好的双靶点pC1300 Cas9∷PUL1+2载体通过热激转化到农杆菌EHA105中，然后转化水稻品种ZH11的愈伤组织。CTAB法提取T0植株的叶片的基因组DNA，并对靶序列位点附近片段设引物，进行PCR酶切验证和Sanger测序分析。结果表明，T0代植株中PCR检测Cas9蛋白和湖霉素都100％呈阳性，pu1的突变频率高达70.5％，主要以单碱基的插入缺失和单碱基替换为主，其中纯合缺失突变率约占20％。 2农艺性状考察 转基因后代的分蘖数，穗粒数，干粒重，粒长，粒宽等农艺性状，进行田间调查，分析结果表明。发现大部分转基因系株高、穗长和剑叶长剑和叶宽无显著差异，分蘖数和结实率显著降低;T0-18的粒长和千粒重极显著增加。 3稻米品质性状分析 T0转基因系进行稻米营养品质检测。以ZH11作对照，分别检测T0-1，T0-6，T0-11，T0--18的总淀粉含量，直连淀粉含量，蛋白质含量，胶稠度和糊化温度等稻米营养指标;结果表明T0种子比ZH11的直链淀粉含量降低，其中T0-6降低了17％，达到显著水平，T0-18的降低了20％，达到极显著水平。T0-1和T0-18的蛋白质含量增加，达到显著水平。 4淀粉合成相关基因表达 PUL基因在敲除突变体中RNA表达量极显著降低。T0的淀粉脱支酶基因表达降低，淀粉合成酶基因SSⅠ和SSⅡ表达增加。提取T0-1，T0-6，T0-18的RNA，以ZH11作对照，检测淀粉合成相关基因GBSSI、SS、BE、ISA，AGPL1、DPE1的表达水平。相比ZH11，T0-6和T0-18的淀粉合成基因SSⅠ表达量增加了2.7倍。控制粒长的基因GL7表达量增加了5倍，从RNA水平上为突变体粒长增加提供证据。 应用CRISPR/Cas9技术成功对普鲁兰酶基因进行编辑，丰富了稻米营养品质与产量的材料基础，加快了品质育种的进程。
水稻;淀粉合成;CRISPR/Cas9;普鲁兰酶;干粒重
中国农业科学院
硕士
作物遗传育种
唐绍清
2017
中文
S511
51
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）