球孢白僵菌非核糖体多肽合成酶组的功能分析
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种虫生真菌，可以侵入6个目15个科的200多种昆虫，并在虫体内大量繁殖，同时产生白僵菌素和卵孢菌素等次生代谢产物，这些物质可引起昆虫中毒，使其新陈代谢紊乱，最终导致昆虫死亡。对于球孢白僵菌侵染昆虫的作用机制，国内外的研究主要集中于研究其侵染的机理，但对其次生代谢产物的生物合成和生物学功能研究还不够深入。非核糖体多肽（nonribosomal peptide，NRP）类化合物是真菌的主要次生代谢产物。基因组分析表明，球孢白僵菌ARSEF2860中含有21个非核糖体多肽的合成基因，但目前只报道了4个基因的合成产物和生物学功能，如白僵菌素等，而大部分的非核糖体多肽的生物合成基因功能未知。为了研究这些未知基因的功能，本论文利用生物信息学的方法，系统地分析了球孢白僵菌ARSEF2860的21个非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)，并按功能将其分为3类，通过基因敲除和感染小菜蛾实验，确定了3个参与侵染小菜蛾过程的非核糖体多肽合成酶基因，具体结果如下: 1、antiSMASH和hmmsearch等次级代谢产物分析工具对球孢白僵菌ARSEF2860基因组进行检索，获得21个NRPS基因，和3个聚酮合酶-非核糖体多肽合成酶(polyketidesynthase-nonribosomal peptide synthase，PKS-NRPS)杂合基因。提取非核糖体多肽合成酶的腺苷酰化结构域(Adenylation domain，A domain)构建系统发育树，根据聚类分析的结果，将球孢白僵菌的NRPS按功能分成3类:基础代谢类（7个）、致病相关类（12个）和功能未知类（2个）。 2、在实验室培养条件和侵染小菜蛾条件下，球孢白僵菌ARSEF2860的NRPS表达差异非常明显，通过反转录PCR发现，BBA_08222（致病相关类）和BBA_03671（致病相关类）在侵染宿主过程中被激活，BBA_06727（致病相关类）和BBA_04028（基础代谢类）表达量增加。通过实时荧光定量PCR发现，包括基础代谢类BBA_04028与致病相关类BBA_08222、BBA_03671和BBA_06727在内的10个NRPS基因在侵染第6天表达量上调，可能参与侵染过程。 3、根据荧光定量PCR和反转录PCR的结果，挑选在侵染小菜蛾期间表达量上调的NRPS基因BBA_04028（基础代谢类）、BBA_08222（致病相关类）、BBA_03671（致病相关类）和BBA_06727（致病相关类），利用同源双交换策略进行敲除。突变株和野生型在PDA培养基上的生长发育没有明显的差异。在对小菜蛾幼虫侵染的实验中，BBA_04028、BBA_08222和BBA_03671这3个基因的缺失导致球孢白僵菌致病能力显著下降(p＜0.05)，侵染6天后小菜蛾幼虫的存活率分别为:31.9％，37.3％和54.7％，而野生型侵染后的存活率为10.6％。BBA_06727基因的缺失没有显著降低球孢白僵菌对小菜蛾的致病能力，但被该突变株侵染后的小菜蛾幼虫体表没有被球孢白僵菌分生孢子覆盖，推测其可能参与侵染后菌体对宿主资源的利用。 本研究对球孢白僵菌ARSEF_2860的NRPS功能进行预测分析，结合差异表达和基因敲除实验，筛选并验证了3个在侵染小菜蛾过程中发挥作用的NRPS基因。本研究为进一步分离这些基因合成的次级代谢产物、阐明其生物合成机制和生物学功能提供了实验基础。
球孢白僵菌;非核糖体多肽合成酶;基因敲除
中国农业科学院
硕士
微生物学
徐玉泉
2017
中文
S476.12
67
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）