犬瘟热病毒N蛋白C端变异分析及表位ELISA检测方法的建立
犬瘟热(Canine Distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，死亡率高达50％。该病流行于犬科、鼬科以及浣熊科部分动物，世界范围内分布分布，给养殖业造成巨大的经济损失。核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)是构成CDV核衣壳的主要结构蛋白且能最早诱导机体产生特异性免疫应答，在病毒中表达量最高，具有良好的免疫原性，在CDV的诊断中具有巨大优势。犬瘟热N蛋白C端存在一个高突变区(aa408～519)，该区段变异率较高，具有一定疏水能力且存在大量的潜在抗原表位。有研究发现C端的变化能够对病毒的毒力产生影响，且强弱毒株N蛋白的差异也主要体现在C端这一高变区。因此对该区域的变异及功能分析有助于我们对CDV的深入研究。 为了解犬瘟热病毒N蛋白C端高变区具体的变异情况，本研究首先对采自武汉、上海、长春、大连的102份疑似犬瘟热样品进行检测，检测结果显示19份样品为阳性。对阳性样品N基因片段进行扩增得到19条序列，与19株GenBank的N基因序列进行比对分析。结果发现，在336个核苷酸基因片段中有101个位点发生突变;在N蛋白C端高变区112个氨基酸推导序列中，有36个位点发生改变，N蛋白的C端突变率高达32％，且疫苗株与中国流行株在N蛋白C端存在的差异最大。 鉴于上述分析，用腺病毒载体表达的CDV截短N蛋白(aa401-523)免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合并筛选到2株能够稳定分泌抗CDV N蛋白的MAb，命名为N1-C8和N1-C41。经间接ELISA测定N1-C8和N1-C41培养上清液及小鼠腹水效价分别为1∶1024、1∶106和1∶512、1∶105。Western blot结果显示N1-C8和N1-C41两株MAb在识别CDV的不同毒力毒株上存在差异，可能与CDV强弱毒株在N蛋白上的差异变化有关。通过肽扫描方法筛选出N1-C8的抗原表位为线性表位440ENQGGDKYPIHFNDE454，但并未能够筛选出N1-C41的抗原表位，推测可能是因为其抗原表位为空间构象型。 以筛选出的抗原表位作为包被抗原建立440aa-454aa表位ELISA检测方法。经各项反应条件的优化最终确定多肽最佳包被浓度为1μg/mL;包被时间为4℃过夜;最佳封闭液为5％脱脂乳;最佳封闭时间为37℃2 h;血清最佳稀释倍数为1∶80;二抗最佳稀倍数为1∶4000;血清和二抗最佳孵育条件为37℃1h。计算得到阴阳性血清临界值为0.225;敏感性试验表明，当血清样品稀释倍数为1∶320时仍然能够检测出阳性样品;板内重复性试验变异系数CV值在0.42％～8.50％，板间重复性试验变异系数CV值在0.36％～8.92％，均小于10％;选择MEV、ADV标准阳性血清进行特异性试验，结果显示MEV阳性血清OD450nm值为0.207，ADV阳性血清OD450nm值为0.179，均呈阴性。440aa-454aa表位ELISA检测方法与商品化CDV ELISA试剂盒在检测阳性血清、样品血清以及阴性血清的符合率分别为88.2％、87.2％以及91.6％，表明所筛选出的抗原表位肽有较高的阳性检出率，具有一定的诊断价值。本研究为CDV的ELISA诊断研究开辟了新思路，为CDVN蛋白抗原表位的深入研究奠定基础。
犬瘟热病毒;核蛋白;变异分析;单克隆抗体;抗原表位;ELISA检测
中国农业科学院
硕士
预防兽医学
程世鹏
2017
中文
S852.65
64
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）