基于CRISPR/Cas9介导的绵羊WNT2与FGF5基因编辑研究
毛囊(Hair follicles，HF)是控制羊毛生长发育的器官，次级毛囊的发生是决定细羊毛品质的关键因素，涉及一系列表皮和真皮间持续而复杂的信号通路调控，但对控制次级毛囊发育的相关基因的调节机理却鲜有研究。在本实验室前期研究过程中发现，WNT2在次级毛囊形态发生诱导期表达量差异显著，为进一步研究WNT2基因对毛囊形态发生过程的分子调控机制，并为改善羊毛品质提供技术支撑，本研究首先应用CRISPR/Cas9技术在绵羊细胞水平验证敲除WNT2对毛囊发育关键基因的调控作用;并以高山美利奴羊为研究对象，进一步建立基于显微注射受精卵基因编辑FGF5的技术体系。主要研究结果如下: 1.培养绵羊原代皮肤成纤维细胞，设计并构建了pUC-sgRNA-pSpCas9(BB)-2A-Puro WNT2敲除质粒，通过阳离子脂质体进行细胞转染，通过T7E1酶切试验进行编辑后效率为14.35％，说明成功对WNT2基因进行了基因编辑。通过Q-PCR技术分析WNT2敲除后对毛囊发育相关基因表达的影响，结果表明WNT2相对表达量极显著下调(P＜0.01)，CDH1相对表达量极显著上调(P＜0.01)，说明WNT2基因编辑成功导致其表达量下降，下游基因表达量上调。Caspase3及FGF5表达上调显著（P＜0.05），证明了WNT2基因对FGF5表达存在抑制作用，同时WNT2基因表达下调会激活凋亡通路，导致细胞凋亡，研究证明WNT2对毛囊的生长发育具有促进作用，为进一步开展WNT2对绵羊毛囊形态发生的分子调控机制研究奠定了理论基础。 2.通过研究不同促卵泡刺激素（follicle stimμLating hormones，FSH）使用剂量，给药方式及冬季畜舍温度对超数排卵及胚胎移植的影响，优化高山美利奴羊胚胎回收程序，以最大化每次回收中受精卵数量。通过比较，最优的冬季高山美利奴羊ET方案超数排卵及胚胎回收程序应为，畜舍内温度为-8℃，按照六次递减法肌肉注射10mL Folltropin-V，每次注射剂量为2.5mL，2mL，2mL，1.5mL，1mL，1mL的进行超排，并于供体第一次配种后40小时进行胚胎回收。对经过基因编辑实验的后代样本进行研究发现，通过TA连接检测及T7E1酶切鉴定，证明成功对高山美利奴羊受精卵进行了基因编辑并获得了FGF5基因敲除后代，建立了高山美利奴羊基因编辑试验方法，获得了FGF5基因敲除个体，为进一步应用基因编辑技术改善羊毛品质提供了技术支撑。
美利奴羊;CIRPSR/Cas9;WNT2基因;FGF5基因;基因编辑
中国农业科学院
硕士
养殖
杨博辉
2017
中文
S826.86
48
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）