水稻条纹病毒胁迫下抗感品种的差异蛋白质组研究
由水稻条纹病毒(Rice stripe tenuivirus，RSV)引起的条纹叶枯病是一种重要病毒病害，给我国水稻生产带来严重的影响。病毒的侵染和寄主的防御是一个相互博弈的过程。为了完成自身的生命活动，病毒需要招募大量的寄主蛋白。而为了抵御病毒的入侵，植物则会产生大量的抗病相关蛋白，因此病毒与寄主间存在着复杂的互作关系，这种关系在蛋白质层面上则表现为蛋白质组的变化。因此，研究植物受病毒侵染影响的差异蛋白质组能够由表及里的阐明植物的抗病反应、症状形成机制等问题。 本文利用iTRAQ技术分析了RSV侵染对高抗和高感水稻品种蛋白质组的影响，结果表明:高抗品种(镇稻88)共有541个蛋白发生了下调表达，496个蛋白发生了上调表达;在高感病品种（武育粳3号）则有544个下调表达蛋白和509个上调表达蛋白;其中两个品种共有的下调和上调表达蛋白分别有213个和207个。进一步通过RSV侵染后抗、感品种中上调蛋白的差异倍数的比对，获得了25个诱导性抗病相关蛋白。为了解诱导性抗病相关蛋白的功能及所参与的抗病反应，利用UniProt对其进行了GO注释，结果发现这些蛋白主要参与了活性氧代谢、次生代谢产物的生物合成、细胞的程序性死亡、翻译后修饰、细胞壁的结构增强等生命过程。 通过对下调表达蛋白的生物信息分析发现，叶绿体蛋白受病毒侵染影响最大，其中包括牻牛儿基牻牛儿基二磷酸还原酶(Geranylgeranyl diphosphate reductase)、原叶绿素酸酯还原酶B(Protochlorophyllide reductase B)、镁离子螯合酶D亚基(Magnesium-chelatase subunit ChlD，CHLD)、氧依赖性粪卟啉原-Ⅲ氧化酶(Oxygen-dependent coproporphyrinogen-Ⅲ oxidase)、尿原卟啉原脱羧酶2（Uroporphyrinogen decarboxylase2）和谷氨酸-1-半醛2，1-氨基变位酶（Glutamate-1-semialdehyde2，1-aminomutase）等在内的9个蛋白参与了叶绿素的生物合成过程;包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(Ribulose bisphosphate carboxylase small chain)、细胞色素f(Cytochromef，Cytf)、叶绿体光系统Ⅰ反应中心亚基i1样蛋白Ⅰ(Chloroplast photosystemⅠ reactioncenter subunitⅡ-like protein，PSI-D)、叶绿体中的NAD(P)H醌氧化还原酶亚基4L(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit4L)和叶绿体中的NAD(P)H醌氧化还原酶亚基J(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit J）等在内的9个蛋白参与了光合作用。这些蛋白的下调表达可能导致寄主叶绿素的生物合成以及光合作用的受阻，从而导致叶绿体结构的破坏，使植株表现出黄化、褪绿等病害症状。 为明确差异表达蛋白在转录水平上的差异，本文从上调表达蛋白中选择了微管蛋白α-1链（Tubulin alpha-1 chain）、多糖基二糖寡糖-蛋白质糖基转移酶亚基STT3B(Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit STT3B)、谷蛋白毒素-C6(Glutaredoxin-C6)，Os02g0586400蛋白、铜-锌超氧化物歧化酶Ⅰ(Superoxide dismutase[Cu-Zn]1)以及可能的Ⅴ型质子ATP酶亚基H(ProbableⅤ-type proton ATPase subunit H)等6个可能与抗病反应的相关蛋白基因，从下调表达蛋白中选择了光系统Ⅰ P700叶绿素a载脂蛋白A1(PhotosystemⅠ P700 chlorophyll a apoprotein A1)、细胞色素b6-f复合铁硫亚基(Cytochrome b6-fcomplex iron-sulfur subunit)、叶绿素还原酶B(Protochlorophyllide reductase B)以及镁离子螯合酶D亚基（Magnesium-chelatase subunit ChlD）、可能的Ⅴ型质子ATP酶亚基H（ProbableⅤ-typeproton ATPase subunit H)等4可能与症状形成相关的蛋白基因进行了RT-qPCR验证，结果表明这10个蛋白在转录水平和蛋白水平上差异趋势一致，说明了iTRAQ结果可靠。 为进一步探索水稻条纹叶枯病的症状形成机制，利用酵母双杂交系统筛选了与镁离子螯合酶D亚基(CHLD)互作的病毒组分，结果表明，RSV的特异性蛋白(SP)能够与CHLD发生互作。随后构建了CHLD的超表达载体，并进行水稻的遗传转化，获得了33棵CHLD超表达植株，为了进一步探索CHLD在症状形成中的作用准备了实验材料。 此外，利用高通量测序技术鉴定了贵州贵阳辣椒病毒病原，发现黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad beanwilt virus2，BBWV2)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)和辣椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)等多种病毒复合侵染是导致辣椒病毒病严重发生的主要原因。同时建立了BBWV2、ChiVMV、CMV和PVY四种辣椒病毒和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、甜瓜蚜传黄化病毒(Melon aphid-borneyellows virus，MABYV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottlemosaic virus，CGMMV)和西瓜隐潜病毒(Citrullus lanatus cryptic virus，CiLCV)等五种西瓜病毒的多重RT-PCR检测体系，为病害的早期诊断和有效防控提供技术手段。
水稻条纹病毒;iTRAQ;抗病蛋白;多重RT-PCR
中国农业科学院
硕士
植物病理学
李莉
2017
中文
S435.111.1
98
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）