解淀粉芽孢杆菌降解角蛋白机制的初步研究
角蛋白(keratin)属于硬性蛋白，主要存在于动物的表皮组织中，例如毛发，鳞片，羽毛，蹄，角等结构中。具有抗化学试剂和水解酶攻击的性质。角蛋白因其难以降解的特性常被当作农工业副产物被丢弃，造成了很大的浪费。角蛋白降解菌是一类能够直接利用角蛋白作为碳氮源的微生物，角蛋白降解菌能够分泌多种角蛋白降解相关的酶类，如角蛋白酶，蛋白酶以及二硫键还原酶，这些酶类与菌体生长所产生胞联氧化还原系统一起作用于角蛋白，促使角蛋白变性，并使之降解。 本论文比较了10株解淀粉芽孢杆菌菌株的角蛋白降解能力及胞外蛋白分泌情况，发现Bacillus Amyloliquefaciens ACCC19735，可以在24h内将羽毛完全降解。结合SDS-PAGE，LC-ESI-MS/MS的技术手段初步确定了13个角蛋白降解相关的酶类，包括9个蛋白水解相关酶:4个S8家族的蛋白酶(proteinase)，2个M28家族的肽酶(peptidase)，1个M42家族的肽酶(peptidase)，1个M32家族的羧肽酶(carboxypeptidase M32)，1个M17家族亮氨酰氨肽酶LAP(leucyl aminopeptidase);3个NADH代谢相关的酶:二氢硫辛酸脱氢酶DID(dihydrolipoyldehydrogenase)和NAD(P)H依赖型氧化还原酶NADO(NAD(P) H-dependent oxidoreductase);1个氨基酸代谢相关的酶:尿刊酸水合酶UHY(urocanate hydratase)。 通过全基因组测序获得了该菌基因组精细图，结合SDS-PAGE，LC-ESI-MS/MS技术以及生物信息学分析获得了15个角蛋白降解相关基因序列，包括kerk, pam, pam1，pam2, mep, bap，bap2,bap3，serp，cap, lap, nado, did1，did2，uhy。其中kerk基因已被证明是角蛋白降解过程中的关键酶。其他多个基因均未有过角蛋白降解的相关研究。 本研究用大肠杆菌诱导表达型载体pET28a构建了pET28a-pam，pET28a-pam2两个表达载体，并成功实现其在大肠杆菌中的表达，测定了这两个氨肽酶的性质，其中氨肽酶PAM与底物作用的最适温度是45℃，最适pH是7.5，对leu-pNA的比活力为745U/mg，PAM2的最适作用温度为50℃，最适pH为8.0，对Leu-pNA的比活为896U/mg，通过与解淀粉芽孢杆菌发酵液上清的协同实验，验证了这两个蛋白在浓度为10uM的时候，对解淀粉芽孢杆菌羽毛培养基发酵液上清水解角蛋白的效率分别提升28％和46％，在以天青角蛋白为底物时，添加重组酶的水解效率分别提升30％和35％。验证了其在角蛋白降解过程中的作用。
角蛋白;解淀粉芽孢杆菌;降解机制
中国农业科学院
硕士
微生物
杨培龙
2017
中文
Q939.9
77
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）