三种水稻根部线虫(M.graminicola,Hirschmanniella spp.和H.elachista)的形态特征与分子鉴定
水稻（Oryza sativa L.）作为世界范围内最重要的粮食作物之一，是全球超过半数人口的重要粮食来源。然而，水稻生产受到多种生物因素与非生物因素的制约。在生物胁迫中，病原线虫，包括2种叶部线虫和6种根部线虫，是一类重要的病原物能够直接或间接为害水稻生产。本研究重点研究了水稻根结线虫（Meloidogyne graminicola）、水稻根部线虫（Hirschmanniella）和水稻孢囊线虫（Heterodera）的形态及分子鉴定方法。 水稻根结线虫（M.graminicola）是制约水稻生产的重要病害之一，具有独特的生物学特性和生活史使其能够适应在浸水土壤中生活。本研究对21份水稻根结线虫样本（16份来自缅甸，5份来自中国）的rDNA ITS序列进行了比对分析，结果表明rDNA ITS序列比对分析能够将21份水稻根结线虫样本与其他种的线虫区分开，同时发现上述21份样本间ITS序列的遗传差异水平较低。为进一步提高水稻根结线虫分子鉴定的准确性，本研究设计了多对种特异性引物，通过测定各对引物的可靠性、特异性和灵敏度，发现引物对(Mg-F3和Mg-R2)能够扩增出靶标线虫模板DNA中长度为369bp的目的片段，而在其他非靶标生物中无法扩增出结果。双重PCR具备省时间、成本低等优点，能够从多种线虫混合样本中特异性扩增出靶标线虫的目的片段。因此，本研究发现的特异性引物对有助于非线虫专业人员对水稻根结线虫进行鉴定，进而制定相应的防治策略。 水稻根部线虫（Hirschmanniella）是水稻重要病害之一，在大部分水稻产区普遍发生。本研究对24个样本的水稻根部线虫进行了分子与形态学鉴定。分子鉴定结果表明，在全部24个样本中，共发现了2种水稻根部线虫:Hirschmanniella oryzae和Hirschmanniella mucronata，其中在18份样本中只发现了H.oryzae，2份样本中只发现了H.mucronata，其他4份样本中两种水稻根部线虫混合发生。rDNA ITS序列比对结果表明，上述2种水稻根部线虫rDNA ITS序列种间差异性较大（H.oryzae序列同源性为88％-99％，H.mucronata序列同源性为99％）。 在上述分子鉴定的水稻根部线虫中，取12个H.oryzae样本和2个H.mucronata样本进行形态学鉴定，进一步明确分子鉴定结果。H.mucronata的形态学特征与模式标本的描述十分相似，只是相对于已报道的描述，虫体最大直径略大。相对于与已报到的结果，H.oryzae的虫体较宽，‘a’值更高，前端咽食道腺到中食道球的距离更长，尾端有凹痕。根据口针长度和虫体长度，可以区分上述两种水稻根部线虫。 利用RAPD分析，选取60个随机10碱基引物对H.oryzae进行检测与鉴定。其中，引物OPB-04的扩增结果表现出较好的重复性，将其设计为SCAR标记，用于筛选靶标种。本研究在H.oryzae中扩增出长度为475bp的目的片段，在其他种线虫中未扩增出该片段。鉴于水稻根部线虫核苷酸序列及形态学上存在差异，同时使用形态学与分子生物学鉴定能够提高对水稻根部线虫鉴定的准确性。 LAMP具有简便、快捷、灵敏度高的特性，本研究使用LAMP法检测水稻孢囊线虫（Heterodera elachista）。根据rDNA ITS序列，设计了水稻孢囊线虫的LAMP引物。最佳的LAMP反应条件为64℃1h，80℃5min。在最佳反应体系和反应条件下，H.elachista阳性反应的凝胶电泳能够观察到典型的阶梯状条带。此外，加入SYBR GreenⅠ染色剂后，肉眼可以观察到LAMP产物变色，且在侧向层析监测中，监测线和对照线均出现条带。而使用其他种线虫DNA进行LAMP无法得到阳性结果，表明LAMP方法准确度高，并且较普通PCR方法的灵敏度高10倍。鉴于LAMP方法成本低、操作简便、准确度高、灵敏度高，可以作为水稻孢囊线虫检测与诊断的备选方法，是进行检疫检测和制定水稻孢囊线虫可持续防治策略的有效工具。 本研究有助于更好地认识并精确诊断水稻生产中的三种重要病原线虫，为水稻线虫综合防治、研究寄主-线虫互作和制定检疫策略奠定了基础。
水稻根结线虫;水稻根部线虫;水稻孢囊线虫;分子鉴定;形态特征
中国农业科学院
博士
植物病理学
彭德良
2017
中文
S435.11
119
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）