牛胚胎中抗氧化相关lncRNA表达分析及细胞水平功能初探
众所周知，哺乳动物体外胚胎的发育率远远低于体内胚，其妊娠率低和胎儿流产率高均成为牛体外胚胎广泛应用于养牛业的制约因素，进而影响农牧民的收入和我国畜牧业经济的健康、快速和可持续发展。为提高体外胚胎的质量，抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione，GSH)常被用来清除胚胎中的氧自由基，对胚胎发育有至关重要的作用。然而，GSH对胚胎整个转录组水平的影响还不清楚。近年来，随着长链非编码RNA（lncRNA）的不断发现，其调控作用也成为研究的热点和焦点。本文采用单细胞测序技术，对GSH处理后的牛体外受精胚胎进行转录组测序;获得的lncRNA进行生物信息学分析，揭示其在早期胚胎抗氧化方面的功能，寻找其中起关键作用的调控分子或序列。 试验一，通过体外受精方法制备牛胚胎，并培养于含有3 mM GSH的培养液中;分别收集处于8～16-细胞期和桑椹期的胚胎，以非添加组为对照。每个样品收集20枚胚胎，并做两个生物学重复。采用HiSeq2000测序平台，获得lncRNA序列，并对其进行生物信息学分析。测序共得到4273个lncRNAs，其中62％来源基因间区;且其在各个染色体的分布没有明显的偏好性，说明lncRNAs的转录是全基因组范围的。lncRNA的平均表达值、平均长度和平均外显子个数都与已知lncRNA一致，证明测序鉴定lncRNA的可靠性。进一步筛选出23个在对照组上调而处理组下调的lncRNAs，36个在对照组下调而处理组上调的lncRNAs。 试验二，在对照组和处理组中，23个lncRNAs分别与599个和2554个蛋白编码基因共表达，这些基因分别涉及25个和71个功能分类，且主要参与6条和8条信号通路。36个lncRNAs分别与对照组的483和处理组的609个蛋白质编码基因共表达，分别涉及18个和33个功能分类，主要参与5条和10条信号通路。另外，发现14个lncRNAs共表达的差异基因参与谷胱甘肽代谢通路。对23个lncRNAs的临近基因（上下游300 kb）进行GO注释，发现其参与35个功能分类;而36个lncRNAs的临近基因则参与43个功能分类。选取8个lncRNAs进行实时荧光定量PCR，与测序结果进行Fold Change比较，结果其中4个在处理组下调，其余4个则上调，与测序结果一致，说明测序结果的可靠性。可见，在体外培养液中添加GSH，对牛早期胚胎的lncRNA表达谱有显著影响，但其对胚胎发育的作用及其机制还需要进一步研究。 试验三，建立牛颗粒细胞细胞系，经过3 mM和5 mM GSH处理后，采用荧光定量PCR检测4个lncRNAs及6个谷胱甘肽合成和代谢相关基因在其中的表达水平。结果不同浓度的外源GSH均导致CUFF.152963.1和CUFF.30537.1的表达量显著下调;5mM GSH则显著提高颗粒细胞中CUFF.33095.2的表达水平，而对CUFF.42178.2的表达没有影响;3 mM GSH却对CUFF.33095.2和CUFF.42178.2均没有显著影响。同时，3mM和5 mM GSH的处理均显著影响颗粒细胞中GCLC、GCLM、 GSTA1，GSTM基因的表达量，而对GSTP1和GGCT基因的表达没有显著影响。
牛胚胎;谷胱甘肽;长链非编码RNA;转录组测序;共表达分析
中国农业科学院
硕士
动物遗传育种与繁殖
杜卫华
2017
中文
S823
83
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）