猪伪狂犬病病毒细菌人工染色体的构建
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的一种能在大多数哺乳动物中传播的急性传染病。猪为PRV的天然宿主和储存宿主，其临床症状主要表现为仔猪神经症状、妊娠母猪流产、死胎。该病曾在世界范围内流行，给各国养猪业造成了巨大的经济损失。自上世纪80年代起，我国大部分猪场通过免疫Bartha-K61疫苗使该病得到有效控制。但自2011年下半年以来，在我国河南、黑龙江和江苏等多个省市出现了PRV变异株，其基因组与以往PRV毒株相比存在多处插入或缺失，基因型属于Ⅱ型，给养猪业造成了重大的损失。 PRV基因组十分庞大，全长约142 kb，对其基因进行改造和修饰十分困难。传统同源重组方法获得重组病毒效率较低、花费时间长，而利用细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)构建的感染性克隆便于在细菌中对PRV庞大的基因组进行基因的缺失、插入或突变。本研究先将绿色荧光蛋白(GFP)表达盒插入到pBACloxp载体中，得到pBAC-GFP;再将PRV变异株PRVHLJ8的Us4-Us6和Us2-Us1基因片段作为同源臂，分别克隆到pBAC-GFP载体中，得到中间转移载体pBAC-GFP62;然后将线性化中间转移载体与PRV HLJ8基因组共转染Vero细胞，获得携带pBAC载体的PRV重组毒vBAC-HLJ8。提取vBAC-HLJ8环化基因组并电转化至大肠杆菌DH10B中，利用PCR方法筛选阳性BAC克隆后，转染Vero细胞获得了resBAC-HLJ8。病毒增殖曲线显示resBAC-HLJ8与PRVHLJ8相比，复制变慢。病毒拯救表明成功构建了PRV变异株HLJ8的细菌人工染色体。利用同样的方法，成功构建了PRV弱毒疫苗株Bartha-K61的细菌人工染色体。 为提高重组病毒的筛选效率，本研究将中间转移载体、PRV HLJ8基因组和pCas9质粒（含有针对同源臂或同源臂内侧基因的gRNA）共转染Vero细胞。研究发现用单一gRNA切割同源臂内侧基因，或两个gRNAs同时切割同源臂内侧基因，都能有效提高重组病毒的产率。尤其是双gRNA切割，能高效地促进BAC载体的插入。 PRV变异株HLJ8、PRV弱毒疫苗株Bartha-K61细菌人工染色体的成功构建，为今后对PRV基因组进行快速、准确修饰奠定基础。同时，利用CRISPR/Cas9技术切割基因能有效提高重组效率，大大缩短获得BAC重组病毒的时间。这一发现同时也为其他DNA病毒的重组体的构建提供了一个良好的解决办法，具有较为重要的科学意义。
伪狂犬病病毒;细菌人工染色体;CRISPR/Cas9;感染性克隆;同源重组
中国农业科学院
硕士
预防兽医学
安同庆
2017
中文
S852.65
51
2018-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）