米托蒽醌对斑马鱼胚胎的急性毒性作用及其分子机制研究
抗肿瘤类药物对水生脊椎动物的发育毒性作用日益受到关注，米托蒽醌是一种典型的抗肿瘤类药物，通过抑制DNA复制和RNA转录达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。本研究以盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone hydorehloride，MA)为试验用药，以斑马鱼胚胎为受试材料，检测米托蒽醌对斑马鱼胚胎的发育毒性和器官毒性作用，探究其毒性作用分子机制，为抗肿瘤类药物的发育毒性评价和风险管理提供理论依据。 通过斑马鱼（AB品系）胚胎96h急性毒性暴露实验，发现MA对斑马鱼胚胎/幼鱼具有致死效应，其浓度-致死率曲线为典型的S型曲线;根据致死率方程，计算96 h半数致死浓度为880μg/L，表明MA在水体环境中属于剧毒物质;MA的致死效应主要发生在斑马鱼胚胎发育早期(24 hpf内)。 MA急性暴露对早期斑马鱼胚胎(＜48 hpf)具有致畸效应。显微成像结果表明，MA诱导斑马鱼胚胎躯干前段弯曲和尾部畸形，如尾部缺失、尾部组织萎缩;组织切片和HE染色实验表明，胚胎尾部组织肌细胞排列松散，细胞边缘模糊，细胞核扩散，肌丝消失;在基因水平上，胚胎早期尾部发育相关基因marksa、marksb、supt5h和ta异常表达。MA急性暴露诱导P53凋亡通路基因apaf1、baxa、bcl2、casp3a和tp53基因表达水平显著上调，表明MA可能通过P53细胞凋亡途径诱导斑马鱼胚胎尾部畸形。 MA急性暴露可引发斑马鱼胚胎的肝脏毒性。MA诱导72 hpf斑马鱼胚胎肝脏组织紊乱、结构松散、空泡化和肝细胞肿胀等病理现象。通过底物特异性酶活检测，发现72/96 hpf胚胎SOD和GST的酶活变化和MDA含量变化对MA表现出浓度依赖性，表明MA引起胚胎氧化应激反应和脂质过氧化，可能是导致肝脏毒性的原因之一。 MA急性暴露对斑马鱼胚胎产生神经毒性。体视显微镜下统计分析，发现MA抑制24 hpf斑马鱼胚胎自主性抽搐;在基因水平上，100μg/L MA显著抑制24 hpf胚胎神经系统发育相关基因bdnf-v2、gap43、hand2、nkx2.2a-v1、neurog、shha和syn2a的表达，其mRNA表达普遍下调2倍以上。MA急性暴露抑制24 hpf胚胎神经系统发育，特别是抑制神经元生长发育和突触形成。 MA暴露导致的细胞凋亡和神经毒性由即刻早期基因介导。根据实时定量PCR数据，发现MA急性毒性暴露导致斑马鱼胚胎DNA损伤，诱导即刻早期基因fos、jun和myc等基因上调表达，对靶基因进行表达调控，进而诱导神经细胞增殖和分化，干扰神经系统发育。jun基因编码产物还通过与DNA相互作用以及激活P53途径，诱导细胞凋亡。 非编码RNA参与调控了MA诱导的细胞凋亡和神经毒性作用。RNA-seq和生物信息学分析共筛选得到6456个lncRNA转录本，发现差异表达lncRNA的靶基因富集到细胞凋亡、细胞周期、P53信号通路等KEGG通路，进而影响细胞增殖和细胞凋亡。筛选到32849个斑马鱼胚胎circRNA，在斑马鱼胚胎不同发育阶段，MA诱导的差异表达circRNA的来源基因同时富集到神经活性配体-受体互作通路，表明circRNA可能参与调控MA诱导的机体细胞神经毒性作用。
米托蒽醌;斑马鱼胚胎;急性毒性;靶标器官毒性;非编码RNA
中国农业科学院
博士
生物化学与分子生物学
闫艳春
2017
中文
R965
112
2017-12-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）