TLR2调控角膜移植术后MDSC分化及DC成熟
研究背景： 角膜移植手术是目前治疗不可逆性角膜盲唯一有效手段。尽管角膜一直被称作“免疫赦免”组织，但移植术后的免疫排斥反应仍是导致移植失败最主要的原因。角膜移植排斥反应是以CD4+T细胞介导为主的Th1型免疫反应。干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)的增高决定T细胞向Th1方向分化，是Th1型免疫反应的特征性因子。CD4+T细胞的激活不仅需要T细胞表面受体(T eel1receptor，TCR)-主要组织相容性抗原(Major histocompatibility complex，MHC)肽复合体的结合，还需要抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)提呈抗原。骨髓抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是APC的前体，不具备抗原提呈功能，无法激活T细胞。另外，MDSC也可通过多种途径抑制T细胞活化。其中最主要的途径是分泌诱导型一氧化氮合酶(Induced nitric oxidesynthase，INOS)，降低T细胞活性。树突状细胞（Dendritic cell，DC）是目前认为最有效的APC。成熟后的DC(Mature DC，mDC)，表面高表达B7/BB1(CD80/CD86)分子，这是递呈抗原从而激活T细胞的必备条件。因此，MDSC、DC的产生和活化与CD4+T细胞激活关系十分密切。 Toll样受体(Toll like receptor，TLR)2是广泛表达于免疫细胞表面的模式识别受体。我们课题组前期研究已经发现，TLR2可能参与了大鼠角膜移植术后免疫排斥反应的发生，但其具体机制仍不十分明确。在体外实验中，已经发现激活TLR2可以促进MDSC向DC分化，并对MDSC活化和DC成熟有一定影响。因此我们猜测TLR2可能通过调控MDSC分化和DC成熟参与角膜移植术后免疫排斥反应的发生。 本实验将利用TLR2基因敲除小鼠建立同种异体角膜移植模型，与野生型同种异体角膜移植小鼠进行比较，从而验证TLR2与角膜移植术后免疫排斥反应发生的关系，并进一步探究这一现象背后的机制。 实验一 TLR2敲除后可延长角膜植片生存时间 研究目的： 验证TLR2参与角膜移植术后免疫排斥反应的发生。 研究方法： 以野生型C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠为受体，BABL/c小鼠为供体，在受体小鼠右眼行同种异体角膜移植术，分别设为野生组（WT组）和基因敲除组（TLR2 KO组）;另外于C57BL/6小鼠右眼行自体角膜移植术，设为自体组(ISO组)。未经手术处理的C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠分别设为野生对照组(WTcontrol)和基因敲除对照组(KO control)。术后2次/周裂隙灯下观察植片水肿程度和透明度，参照Sonoda评分标准对排斥指数（Reject index，RI）进行评分并计算中位生存时间(Median survival time，MST)。比较WT组与TLR2 KO组间植片生存时间长短。 研究结果： 术后随时间变化各手术组植片水肿和混浊程度不一，以WT组最为严重。比较角膜RI评分显示，术后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49 d和56d，TLR2KO组RI评分均低于WT组(P＜0.05)。比较MST结果显示，TLR2 KO组（35.0±3.8）d明显长于WT组（21.0±1.5）d(P＜0.05)。生存分析结果显示，TLR2 KO组角膜生存时间明显长于WT组(P＜0.001)，术后14d TLR2 KO组角膜生存率为100％，而WT组仅为70％。 结论： TLR2敲除后可延长角膜植片生存时间，再次验证TLR2可能参与角膜移植术后免疫排斥反应的发生。 实验二 TLR2调控角膜植片局部免疫反应发生 研究目的： 探究TLR2是否调控同种异体移植角膜植片局部的免疫反应的发生。 研究方法 建立WT组、TLR2 KO组、ISO组、WT control组和KO control组五组小鼠（方法同前）。术后14d，收集术眼角膜行HE染色分析炎症细胞浸润程度;免疫组织化学染色检测角膜TLR2及Th1细胞因子(IFN-γ)蛋白表达;实时荧光定量PCR检测TLR2及IFN-γ mRNA的表达;同时收集术眼同侧颈部淋巴结行流式细胞术分析CD4+T细胞(CD3+CD4+)的比例。 研究结果： TLR2免疫组织化学和PCR结果显示，TLR2 KO组角膜几乎不表达TLR2分子，ISO组有微量表达，WT组表达明显增高。HE染色结果显示，WT组角膜基质层出现水肿和大量炎性细胞，而TLR2 KO组炎症反应较轻。流式细胞分析结果显示，WT组同侧颈部淋巴结中CD4+T细胞数量明显高于TLR2 KO组(P＜0.05)。免疫组织化学和PCR结果显示，WT组相对于TLR2 KO组，角膜植片内IFN-γ表达增高(P＜0.05)。 结论： TLR2表达高低与植片局部免疫反应强弱相关，提示TLR2可能参与了同种异体移植角膜植片局部的免疫反应的发生。 实验三 TLR2调控MDSC分化及DC成熟 研究目的： 探究TLR2是否调控MDSC分化及DC成熟。 研究方法： 建立WT组、TLR2 KO组、ISO组、WT control组和KO control组五组小鼠（方法同前）。术后14d，收集术眼角膜行实时荧光定量PCR检测INOS mRNA表达分析各组MDSC功能差异;免疫荧光染色检测角膜局部MDSC、DC数量分析各组MDSC向DC分化的情况，以及CD80/CD86表达强弱分析各组DC成熟的情况。同时收集术眼同侧颈部淋巴结行流式细胞术定量分析MDSC(CD11b+GR-1+)、DC(CD11c+)的比例和和mDC(CD11c+CD86 high/CD80high)的表达。 研究结果： PCR结果显示，WT组与TLR2 KO组间角膜局部INOS mRNA表达无明显的差异(P＞0.05)。MDSC和DC的流式细胞分析和免疫荧光结果结果显示，WT组相对于TLR2 KO组，眼球局部MDSC数量减少(P＜0.05)，但DC的数量增多(P＜0.05)。流式细胞分析结果和免疫荧光结果均显示，WT组相对于TLR2KO组，DC表面CD86/CD80分子表达高(P＜0.05)，DC成熟度高。 结论： TLR2可能参与了角膜移植术后MDSC向DC分化及DC成熟，但TLR2缺乏并不影响MDSC活化。
角膜移植手术;Toll样受体;树突状细胞;骨髓抑制性细胞;动物模型
南方医科大学
硕士
眼科学
白浪
2017
中文
R779.65
82
2017-12-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）