HMGA2及let-7d miRNA对糖尿病肾脏病肾小管上皮细胞转分化及肾脏纤维化的调控
背景和目的: TGFβ1诱导的肾小管上皮间质转化(EMT)在糖尿病肾脏病(DKD)肾纤维化中起关键作用，HMGA2被报道通过多重机制参与TGFβ1诱导的EMT的发生过程。微小RNA(miRNA)作为重要的转录后水平调控因子也参与EMT的发生。既往对TGFβ1/HMGA2在EMT中的研究多集中于肿瘤或其他器官领域，而在DKD背景下，尤其是在肾小管上皮细胞EMT及纤维化进程中的作用目前并不明确。本研究拟探讨HMGA2对TGFβ1诱导的肾小管上皮细胞EMT及纤维化过程的影响和作用，并进一步针对靶基因HMGA2，研究其上游miRNA对HMGA2的影响及参与DKD肾纤维化的潜在作用机制。通过上述研究，将有助于我们据此针对有效的信号通路发现重要的干预和治疗靶点，从而为DKD肾纤维化的治疗提供新的思路。 方法: 1.建立TGFβ1刺激大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）的细胞模型，利用qRT-PCR及western blot的方法检测TGFβ1刺激前后HMGA2及EMT相关基因的表达变化。 2.利用siRNA转染的方法验证HMGA2在TGFβ1诱导的EMT及肾纤维化中的作用，用qRT-PCR及western blot检测siRNA沉默HMGA2基因前后其下游转录因子的表达变化。 3.通过生物信息学方法，针对靶基因HMGA2筛选有价值的上游miRNA，用qRT-PCR检测TGFβ1诱导NRK-52E细胞前后各miRNA的表达差异，同时进一步于UUO小鼠模型中探索HMGA2及其上游miRNA的表达变化。 4.通过过表达（转染miRNA mimics）和抑制(转染miRNA inhibitors)的功能实验进一步验证筛选出的miRNA对TGFβ1诱导的EMT和肾纤维化的影响和作用。用qRT-PCR及western blot检测HMGA2及EMT相关因子于miRNA过表达及抑制前后的表达情况。 结果: 1.qRT-PCR及western blot结果表明:给予10ng/mL TGFβ1刺激NRK-52E细胞48h后，与Control组比较，TGFβ1(48h)组中HMGA2、α-SMA、vimentin、Col-Ⅰ及FN的表达均明显升高，E-Cad的表达明显降低。 2.qRT-PCR及western blot结果表明:转染siRNA-HMGA2能明显抑制TGFβ1诱导的NRK-52E细胞中HMGA2及α-SMA、vimentin表达的上调以及E-Cad表达的下调;转染siRNA-HMGA2对其下游转录因子Snail，Slug和Twist的表达无明显影响。 3.针对靶基因HMGA2，筛选出有价值的上游miRNA: miRNA-let-7d、miRNA-98、miRNA-33; qRT-PCR结果显示:miRNA-let-7d在TGFβ1诱导的NRK-52E细胞及UUO小鼠肾脏中的表达均明显降低，而HMGA2的表达则呈反向升高;TGFβ1的刺激对miRNA-98及miRNA-33的表达无明显影响。 4.qRT-PCR及western blot结果表明:转染let-7d mimic能明显抑制TGFβ1诱导的NRK-52E细胞中HMGA2及α-SMA、Col-Ⅰ、FN表达的上调以及E-Cad表达的下调;转染let-7d inhibitor能明显增强TGFβ1诱导的HMGA2及Col-Ⅰ、FN表达的上调以及E-Cad表达的下调。 结论: 1.TGFβ1可诱导NRK-52E细胞中HMGA2的高表达，并使细胞发生EMT及纤维化改变。 2.对HMGA2进行基因沉默(siRNA-HMGA2)可逆转TGFβ1诱导的EMT及纤维化改变，它是一个重要的靶基因。 3.miRNA-let-7d为HMGA2重要的上游miRNA，miRNA-let-7d/HMGA2在TGFβ1诱导的EMT及肾纤维化进程中可能发挥作用。 4.过表达miRNA-let-7d可下调HMGA2的表达，进而抑制TGFβ1诱导的EMT及肾纤维化改变;抑制miRNA-let-7d可上调HMGA2的表达，进而加快TGFβ1诱导的EMT及肾纤维化进展。 5.miRNA-let-7d可能通过调节HMGA2的表达从而调控肾小管上皮细胞转分化及纤维化，干预这一过程可能是一个预防和治疗DKD肾纤维化的新途径。
糖尿病肾脏病;肾小管上皮细胞;肾脏纤维化;HMGA2蛋白;微小RNA
南方医科大学
博士
内科学（内分泌与代谢病）
薛耀明
2017
中文
R587.2;R692
104
2017-12-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）