二氢杨梅素调控FLCn-FNIP1/AMPK通路抑制肥胖诱导的骨骼肌纤维类型转换
糖尿病已成为全球性的重大公共卫生问题，我国的糖尿病发病现状尤为严峻，18岁以上成年人中糖尿病患病率为11.6％，糖尿病前期患病率更是高达50.1％。骨骼肌组织是人体内最大的糖脂代谢库，骨骼肌胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生发展过程中起着至关重要的作用，因此改善骨骼肌胰岛素抵抗成为防治糖尿病的关键所在。肥胖是骨骼肌胰岛素抵抗发生的最主要危险因素，循环中游离脂肪酸升高在肥胖导致骨骼肌胰岛素抵抗中扮演了重要角色，但其引发骨骼肌胰岛素抵抗的确切机制仍未完全阐明。 骨骼肌是由具有不同收缩功能与代谢特性的肌纤维组成的，哺乳动物骨骼肌纤维分为Ⅰ型（慢收缩肌纤维）和Ⅱ型（快收缩肌纤维）两大类，肌纤维表型具有高度的可塑性，当机体受到某些生理或病理刺激时，通过肌纤维类型决定的相关信号通路变化，调节肌纤维特异基因表达水平继而诱导肌纤维表型发生转换。已有研究证据表明骨骼肌对胰岛素的敏感性与慢肌纤维比例呈正相关，而肥胖时存在部分骨骼肌纤维由慢肌转换为快肌的现象，继而导致慢肌纤维比例降低。因此，我们推测肥胖状态下循环中游离脂肪酸升高可能通过诱导骨骼肌纤维类型由慢肌纤维向快肌纤维类型转换，降低慢肌纤维比例，继而导致骨骼肌胰岛素抵抗。 AMPK-PGC-1α信号通路在调节骨骼肌纤维表型转换中起着重要作用。磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是机体内重要的能量代谢感受器，AMPK激活后调节其下游的靶基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)表达，继而促进慢肌纤维特异基因表达、线粒体生物合成等，使慢肌纤维比例增加。已有大量研究证据表明在肥胖、代谢综合症、2型糖尿病等胰岛素抵抗患者的骨骼肌组织中AMPK活性和慢肌纤维比例明显降低。新近研究发现，抑癌基因Folliculin(FLCN)及其相互作用蛋白1(folliculin interacting protein1，FNIP1)形成的FLCN/FNIP1复合体是AMPK活性的负性调节因子，FLCN或FNIP1的基因敲除可以显著增强骨骼肌中AMPK活性，PGC-1α表达水平，明显增加慢肌纤维比例，而同时敲除PGC-1α后，慢肌纤维比例显著下降，表明FLCN/FNIP1通过抑制AMPK-PGC-1α信号通路调控肌纤维表型转化，降低慢肌纤维比例。由此可见，FLCN/FNIP1复合体对于骨骼肌纤维类型决定起着重要作用，然而肥胖对骨髂肌FLCN和FNIP1表达以及肌纤维表型转换的影响尚未见有研究报道。 二氢杨梅素是药食两用植物藤茶（学名显齿蛇葡萄）中含量极高的一种特征性黄酮类化合物成分，中医应用藤茶解酒和治疗肝病已有上百年的历史。近年来，我们发现二氢杨梅素具有防治非酒精性脂肪肝病，提高低氧条件下运动耐力，促进肌肉因子(irisin)分泌等多种生物学效应。更为重要的是，我们前期通过体外实验和动物实验研究已经证实二氢杨梅素可通过激活AMPK介导的自噬改善高脂诱导的骨骼肌胰岛素抵抗。鉴于肌纤维类型转换与肥胖导致胰岛素抵抗的潜在关联性，以及AMPK-PGC-1α信号通路对肌纤维表型决定的重要作用，二氢杨梅素能否通过调节骨骼肌纤维类型转换进而改善肥胖诱导的胰岛素抵抗值得深入研究。 综合以上分析，本课题提出如下研究假设:二氢杨梅素可通过调控FLCN-FNIP1/AMPK通路抑制游离脂肪酸诱导的骨骼肌纤维类型转换，慢肌纤维比例下降，进而改善胰岛素抵抗。本文采用高脂喂养诱导的肥胖C57BL/6J小鼠胰岛素抵抗模型、遗传性肥胖ob/ob小鼠胰岛素抵抗模型和棕榈酸诱导C2C12细胞胰岛素抵抗模型，运用免疫印迹、PCR、Seahorse线粒体呼吸仪、激光共聚焦、免疫组织化学染色、细胞质粒转染等技术手段，研究游离脂肪酸水平与骨骼肌肌纤维组成及能量代谢、胰岛素敏感性相互之间的相关性，观察二氢杨梅素干预对肥胖所致骨骼肌肌纤维类型、能量代谢及胰岛素敏感性改变的抑制效应，并深入探讨FLCN/FNIP1/AMPK通路在二氢杨梅素改善肥胖诱导的骨骼肌纤维类型转换和胰岛素抵抗中的可能作用。 主要实验结果和结论如下: 1.高脂喂养诱导的肥胖C57BL/6J小鼠和遗传性肥胖ob/ob小鼠均出现了明显的胰岛素抵抗和骨骼肌慢肌纤维比例的降低，二氢杨梅素干预可以明显改善肥胖导致的慢肌纤维比例降低和胰岛素抵抗。此外，相关性分析结果显示慢肌纤维比例与胰岛素抵抗呈显著的负相关，提示肥胖可能通过诱导骨骼肌纤维类型转换，导致慢肌纤维比例降低，继而引起胰岛素抵抗。 2.两种肥胖模型小鼠的血浆中游离脂肪酸含量均明显升高，并且相关性分析结果显示，游离脂肪酸水平与HOMA-IR指数呈明显的正相关，而与慢肌纤维比例呈明显的负相关，表明肥胖导致的骨骼肌纤维转化可能是由游离脂肪酸升高引起的。二氢杨梅素干预对游离脂肪酸水平并无显著影响，但其显著改善肥胖诱导的慢肌纤维比例的降低和胰岛素抵抗，提示二氢杨梅素可能通过直接影响介导游离脂肪酸诱导肌纤维类型转换的相关信号通路，抑制肥胖诱导的慢肌纤维比例降低，从而改善胰岛素抵抗。 3.棕榈酸作为肥胖状态下升高最明显的游离脂肪酸之一，已被体外实验证实可以诱导多种细胞产生胰岛素抵抗。本实验结果显示，棕榈酸处理的小鼠C2C12肌管中慢肌纤维标志分子Myh7表达水平显著降低，并伴有明显的胰岛素抵抗，二氢杨梅素干预可以明显拮抗棕榈酸诱导的Myh7表达下降和胰岛素抵抗，表明二氢杨梅素改善棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗可能与其抑制肌纤维类型转换有关。 4.在肥胖小鼠的比目鱼肌组织和棕榈酸诱导的C2C12肌管中，FLCN、FNIP1蛋白表达明显增高，而p-AMPK的蛋白表达和PGC-1α基因表达显著降低;二氢杨梅素干预可以明显抑制FLCN、FNIP1的表达增加，p-AMPK，PGC-1α的表达降低。此外，沉默FLCN基因可以明显逆转棕榈酸诱导的Myh7蛋白表达，AMPK活性，p-Akt、p-IRS-1蛋白表达，以及葡萄糖摄取能力的降低;过表达FLCN基因可以显著抑制二氢杨梅素对棕榈酸诱导的上述变化的拮抗效应。结果提示FLCN/FNIP1/AMPK信号通路在二氢杨梅素改善肥胖诱导的骨骼肌纤维类型转化和胰岛素抵抗中起着重要作用。 综上所述，肥胖状态下，循环中游离脂肪酸升高（棕榈酸）可通过诱导骨骼肌纤维类型转换，降低慢肌纤维比例，继而引起胰岛素抵抗;FLCN/FNIP1/AMPK信号通路在肥胖导致的慢肌纤维比例降低和胰岛素抵抗中起着至关重要的作用;二氢杨梅素干预可通过调控FLCN/FNIP1/AMPK信号通路抑制肥胖诱导的骨骼肌纤维类型转换，继而改善胰岛素抵抗。
糖尿病;骼肌;纤维类型转换;游离脂肪酸;胰岛素抵抗;二氢杨梅素
中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学
博士
营养与食品卫生学
糜漫天;朱俊东
2017
中文
R587.1;R285.5
111
2017-12-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）