二氢杨梅素通过抑制PPARγ磷酸化改善胰岛素抵抗的作用及机制研究
糖尿病是严重危害人类健康的慢性非传染性疾病，中国的2型糖尿病发病率呈现出逐年上升的趋势，成为糖尿病患病大国，糖尿病的防治研究任重道远。胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的重要机制之一，改善胰岛素抵抗是临床治疗糖尿病的主要策略。植物化学物具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种生物学活性，在疾病的防治中有着重要应用价值。其中类黄酮化合物因其具有降血糖、低毒副作用的功效而备受关注，但其具体机制尚不明了。 过氧化物酶体增殖物激活受(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)-γ参与调节机体糖脂代谢，是临床研发抗糖尿病药物的重要靶点。其中胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione，TZD)药物如罗格列酮(Rosiglitazone，ROSI)虽具有良好降糖效果，但其最为PPARγ的一种完全激动剂可导致成脂增加和肥胖。研究发现类黄酮化合物能通过部分激活PPARγ增强胰岛素敏感性的同时，减少成脂、肥胖和水肿等诸多罗格列酮药物的副作用。二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DHM)作为一种类黄酮化合物，具有抗炎、抗氧化、抗酒精性中毒和抗肿瘤等多种生物学活性，也有研究报道其具有降血糖作用，但具体机制还有待进一步阐明。 研究发现，PPARγ的磷酸化与胰岛素抵抗的发生密切相关。抑制PPARγ273位点丝氨酸的磷酸化是PPARγ的配体发挥降糖作用的主要机制。细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular Regulating Kinase，ERK)和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependentKinase，CDK5）都能介导PPARγ273位点的磷酸化，导致肥胖相关的胰岛素抵抗的发生。抑制MEK/ERK通路能显著提高动物胰岛素敏感性。多种类黄酮化合物均被证实能抑制MEK/ERK信号通路促进肿瘤细胞凋亡。基于结构-效应关系理论推理和本课题组前期计算机模拟分子对接发现DHM能直接与PPARγ的配体结合区结合，我们推测类黄酮化合物DHM可能通过调控MEK/ERK，抑制PPARγ273位点的磷酸化，进而提高胰岛素敏感性，有效降低血糖。 实验方法: 本研究包括体内动物实验和离体细胞实验两部分。以Zucker Diabetic Fatty(ZDF)糖尿病模型大鼠和3T3-L1脂肪细胞为研究对象。 1.实验分组:健康对照组ZL大鼠，ZDF对照组，DHM（50mg/kg）组，DHM(100mg/kg)组，DHM(200mg/kg)组，罗格列酮(4mg/kg)组;每日灌胃，共8周。隔日记录体重，每周测量进食量和空腹血糖、胰岛素、胰高血糖素水平，第0、4、8周测量血脂水平、脂联素和FGF21水平，实验第7周进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)，第8周进行胰岛素耐量实验(ITT)。 2.干预第7周，活体小动物CT成像分析大鼠体成分组成。 3.实验结束后取肝脏、胰腺、肾脏、脂肪组织进行油红O染色、组织化学染色或免疫组织化学染色。Western Blot测定ZDF大鼠脂肪组织PPARγ蛋白表达及磷酸化。 4.采用地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗模型，分析DHM对细胞成脂分化、糖摄取能力的影响。ELISA检测脂肪因子的分泌。 5.Westem Blot测定脂肪细胞PPARγ磷酸化水平及其上游调控激酶ERK/CDK5的蛋白表达水平。使用PPARγ抑制剂GW9662阻断PPARγ活性，观察其对DHM对脂肪细胞糖摄取和脂联素分泌的影响;用MEK抑制剂PD98059阻断ERK活性，对比研究DHM和MEK抑制剂的作用效应。 主要实验结果: 1.DHM降低ZDF大鼠空腹血糖，提高胰岛素敏感性。中、高剂量(100mg/kg和200mg/kg) DHM组大鼠空腹血糖显著低于ZDF对照组，低剂量（50 mg/kg）DHM维持大鼠空腹血糖低于10mM到实验第7周。第7周口服葡萄糖耐量实验(Oral GlucoseTolerance Test，OGTT)显示，3个剂量DHM组口服葡萄糖30min后血糖值均显著低于ZDF对照组;第8周胰岛素耐量实验(Insulin Tolerance Test，ITT)显示，中、高剂量(100mg/kg和200mg/kg) DHM组在注射胰岛素30min后，血糖显著低于ZDF对照组。 2.DHM改善糖尿病大鼠血脂水平，不引起动物体重增加。DHM显著降低血清TG和LDL-C水平，升高HDL-C水平。干预第8周末，DHM组大鼠体重增加量比罗格列酮组降低了56％～74％。 3.DHM对糖尿病大鼠的肝脏、胰腺和肾脏有保护作用。DHM降低肝细胞脂质沉积、维持肝小叶正常形态、减缓肝脂肪样变。DHM增加胰岛体积，维持胰岛形态完整性，提高β细胞的胰岛素含量。DHM显著降低肾间质炎细胞浸润，减少肾小球系膜基质增生。 4.DHM降低糖尿病大鼠的脂肪组织含量，减小脂肪细胞体积，增加脂联素分泌。体成分组成显示，与罗格列酮相比DHM显著降低大鼠总脂肪和内脏脂肪含量。脂肪组织油红O染色显示，ZDF对照大鼠皮下、内脏脂肪细胞体积显著增大，DHM降低脂肪细胞体积，其皮下、内脏脂肪细胞大小与ZL健康对照组无显著差异。第0，4，8周分别进行血清脂联素水平检测，ZDF对照组脂联素水平进行性下降，而DHM显著升高血清脂联素水平，与ZL健康对照组无明显差异。 5.体内和体外实验Western Blot结果均显示，DHM抑制脂肪组织和细胞中PPARγ273位点丝氨酸磷酸化，而且DHM抑制PPARγ磷酸化能力优于罗格列酮。此外，DHM还显著降低调节PPARγ磷酸化的激酶ERK和CDK5的活性。 6.在地塞米松建立的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型中，DHM剂量依赖性的显著提高细胞的糖摄取能力，增加脂肪细胞分泌脂联素和FGF21水平。PPARγ抑制剂GW9662阻断了DHM提高脂肪细胞糖摄取和增加分泌脂联素、FGF21的能力。DHM表现出与MEK抑制剂PD98059相同的提高脂肪细胞糖摄取和促分泌脂联素、FGF21的作用，且两者联用具有协同效应。 结论: 1.DHM能降低ZDF糖尿病大鼠空腹血糖，减轻胰岛素抵抗，改善血脂水平。此外，DHM减少肝脏脂质沉积，增加胰腺组织胰岛的体积和胰岛素含量，缓解肾间质炎细胞浸润和肾小球系膜基质增生。研究同时发现，长期使用DHM并不引起动物体重的过多增加。 2.体内实验中，DHM降低糖尿病大鼠体脂含量，缩小脂肪细胞体积，增加脂肪细胞脂联素水平。体外实验中利用地塞米松建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型，发现DHM提高胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞糖摄取能力，促进脂肪细胞分泌脂联素和FGF21。 3.通过调节MEK/ERK信号通路抑制PPARγ Ser273磷酸化是DHM降低胰岛素抵抗的主要作用机制，且DHM和MEK抑制剂协同作用，提高脂肪细胞胰岛素敏感性。 综上所述，本研究进一步揭示了二氢杨梅素(DHM)改善胰岛素抵抗的分子作用机制，首次提出抑制PPARγ273位点丝氨酸的磷酸化是DHM的作用机制，为将藤茶或其提取物DHM应用于临床糖尿病的防治提供了重要的科学依据。
2型糖尿病;二氢杨梅素;胰岛素抵抗;过氧化物酶体增殖物激活受-γ;实验药理
中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学
博士
营养与食品卫生学
糜漫天
2017
中文
R587.1;R977.15
126
2017-12-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）