表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验
H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)自1992年首次在我国鸡群中被发现并报道以来，迅速在各地流行，严重危害养禽业的发展。研究表明，H9N2亚型AIV不经适应即可感染人和哺乳动物，也可为感染人的流感病毒提供内部基因，具有重要的公共卫生意义。在我国，独特的地理环境、养殖模式及活禽市场的存在为H9N2亚型AIV的传播提供了有利条件，而免疫压力更是病毒发生重组和变异的重要因素。通过对我国2010年～2015年间H9N2亚型AIV分离毒株的血凝素(HA)基因序列分析显示，近年来的分离毒株主要集中于h9.4.2.5分支上，而常用的灭活疫苗的毒株并不属于此分支，且灭活疫苗不能有效地诱导细胞免疫应答和黏膜免疫应答。因此，灭活疫苗的免疫保护率有时不高。火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey, HVT)疫苗是预防鸡马立克氏病的常用疫苗，具有较多的复制非必需区可供外源基因的插入，被广泛应用于重组病毒活疫苗的构建。本研究拟以HVT FC126疫苗株为载体，构建表达h9.4.2.5分支H9N2亚型AIV HA的重组病毒，研制新型H9亚型AIV活疫苗。 本研究通过PCR扩增出h9.4.2.5分支H9亚型AIV（YZ1406毒株）的HA基因，与人巨细胞病毒早期启动子(CMV)和TK polyA组成表达盒。将该表达盒插入到HVT FC126疫苗株的US2非必需区片段中，构建转移载体pHVT-H9HA。将pHVT-H9HA与表达EGFP基因的重组HVT FC126病毒（rHVT-EGFP）基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，经同源重组，将位于rHVT-EGFP US2区内的EGFP标记基因替换为HA基因表达盒，获得重组病毒rHVT-H9HA。通过PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光试验对rHVT-H9HA进行鉴定，并对其在CEF上的生长特性进行检测。结果显示:rHVT-H9HA中，HA基因表达盒已正确插入到US2复制非必需区内，并能成功表达出大小85kD左右的目的蛋白;同时，rHVT-H9HA在CEF上表现出与HVTFC126疫苗毒株相同的复制水平。 本研究对重组病毒rHVT-H9HA进行了免疫效力的初步评价。将80只1日龄SPF鸡随机分成四组:rHVT-H9HA免疫组、灭活苗免疫组、攻毒对照组和空白对照组。其中rHVT-H9HA免疫组于1日龄经颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的rHVT-H9HA，灭活苗免疫组于14日龄时经肌肉注射0.25 mL/鸡的禽流感病毒H9亚型灭活苗。在7、14、21、28日龄，分别通过血凝抑制试验(HI)检测各组试验鸡的血清中H9亚型AIV的抗体效价。除空白对照组外，其余各组于28日龄均采用点眼/滴鼻方式以108EID50/鸡的YZ1406毒株攻毒。攻毒后的第3d、5d，采集喉头、泄殖腔拭子，进行病毒分离，检测各组试验鸡的排毒情况。结果显示:rHVT-H9HA免疫组的试验鸡在疫苗接种后抗体水平呈持续上升趋势;在攻毒后的第5d，病毒分离率显著降低，而攻毒对照组病毒分离率较高，表明重组病毒rHVT-H9HA对H9亚型AIV的攻击具有较好的保护作用。
火鸡疱疹病毒;H9亚型禽流感病毒;HA基因;同源重组;免疫效力
扬州大学
硕士
兽医学
吴艳涛
2017
中文
S852.65
50
2017-11-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）