表达基因Ⅶ型新城疫病毒HN糖蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建及其免疫效力试验
新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种烈性、高度传染性疾病，给养禽业带来了巨大的经济损失。目前，常规疫苗毒株大多是NDV基因Ⅰ型或基因Ⅱ型，而当前我国优势流行毒株为NDV基因Ⅶ型，虽然它们属于同一血清型，但遗传距离相差较远。因此，免疫鸡群中非典型ND和带毒现象普遍存在，免疫失败时有发生，迫切需要研制与流行毒株基因型相匹配的ND疫苗。火鸡疱疹病毒（herpesvirus of turkey，HVT）疫苗是预防鸡马立克氏病的常用疫苗，具有较多的病毒复制非必需区可供外源基因的插入，被广泛应用于重组病毒活疫苗的构建。本研究拟以HVT FC126疫苗株为载体，构建表达基因Ⅶ型NDV HN糖蛋白的重组火鸡疱疹病毒，研制新型ND活疫苗。 本研究通过PCR扩增出基因Ⅶ型NDV DT-2014株的HN基因，与人巨细胞病毒早期启动子(CMV)和TK poly A组成表达盒。将该表达盒插入到HVT FC126疫苗株的US2非必需区片段中，构建转移载体pHVT-US2-HN。将pHVT-US2-HN转移载体与表达EGFP标志基因的重组HVT FC126病毒(rHVT-EGFP)基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，经同源重组，将EGFP基因替换为HN基因表达盒，获得表达HN蛋白的重组病毒rHVT-US2-HN。通过PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对获得的重组病毒rHVT-US2-HN进行鉴定，并对其在CEF上的生长特性进行检测。结果显示:重组病毒rHVT-US2-HN中，HN基因表达盒已正确插入US2复制非必需区内，并能成功表达大小在70kD左右的目的蛋白。同时，重组病毒rHVT-US2-HN在CEF上表现出了与HVT FC126疫苗毒株相同的复制水平。 本研究对重组病毒rHVT-US2-HN进行了免疫效力的初步评价。将80只1日龄SPF鸡随机分成4组，依次为rHVT-US2-HN免疫组、弱毒疫苗免疫组、攻毒对照组及空白对照组。其中，rHVT-US2-HN免疫组于1日龄颈部皮下接种5000噬斑形成单位(PFU)的rHVT-US2-HN;弱毒疫苗组于7日龄经滴鼻/点眼途径免疫1羽份LaSota疫苗。分别于7、14、21、28日龄采血分离血清，通过血凝抑制试验(HI)检测NDV抗体效价。除空白对照组外，其余3组于21日龄经滴鼻点眼途径以每只鸡105EID50的基因Ⅶ型NDV DT-2014株攻毒。攻毒后第3d、5d，采集喉头、泄殖腔拭子，进行病毒分离，检测各组试验鸡的排毒情况;并连续观察7天，统计各试验组的临床症状、发病率和死亡率。结果显示:rHVT-US2-HN免疫组试验鸡在接种后抗体水平呈上升趋势。攻毒后7天，对照组的死亡率为100％，rHVT-US2-HN免疫组的死亡率为50％，弱毒疫苗免疫组的死亡率为10％。表明重组病毒rHVT-US2-HN对基因Ⅶ型NDV强毒株的攻击有一定的免疫保护效果，为ND的预防和控制提供了新的候选疫苗株。
新城疫病毒;火鸡疱疹病毒;HN基因;同源重组;免疫效力
扬州大学
硕士
兽医学
吴艳涛
2017
中文
S852.65
52
2017-11-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）