基于prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin对副干酪乳杆菌免疫调节的影响
乳酸菌可以与肠道粘膜免疫系统相互作用，在抑制肠道致病菌、调节机体免疫功能、维持肠道微生态平衡等方面发挥重要作用。而乳酸菌发挥益生作用的前提是其与肠上皮细胞的粘附，粘附作用是菌株定植肠道的第一步。乳酸菌对肠道上皮细胞的粘附作用有助于其在肠道定植、增强乳酸菌与肠道细胞之间的交流、抑制病原菌在肠道的定植和提高机体免疫力。因而乳酸菌的粘附性是评价其作为益生菌的重要指标。最新研究发现，在乳酸乳球菌中，细胞外膜的丝氨酸蛋白酶lactocepin除了有水解蛋白质、抗炎等功能外，还能介导乳酸菌的粘附作用，主要是通过影响范德华力的改变。 为了研究lactocepin是否介导乳酸菌的粘附，本文以副干酪乳杆菌为载体，用九-Red重组系统敲除lactocepin的编码基因prtP，构建副干酪乳杆菌lactocepin缺失突变株。并比较了突变株与亲本株在生物学特性、体内外粘附性以及对肠道免疫影响等的差异。主要的结果如下: 比较副干酪乳杆菌亲本株与lactocepin缺失突变株菌的生长曲线、表面疏水性、自凝聚能力、抑制致病菌的能力及药敏性。结果表明，lactocepin缺失，副干酪乳杆菌生长速度减慢，疏水性和自凝聚能力显著下降，抑菌能力无明显变化，对不同抗生素的敏感性有所改变。副干酪乳杆菌亲本株对诺氟沙星、环丙沙星、多粘菌素B、链霉素均具有耐药性;对四环素和青霉素G中度敏感;对利福平、头孢唑林和头孢拉定均敏感，而lactocepin缺失突变株菌突变株对诺氟沙星、多粘菌素B和链霉素均有耐药性;对环丙沙星、青霉素G和头孢拉定中度敏感;对利福平、四环素、头孢唑林均敏感。 本研究还测定了副干酪乳杆菌亲本株与lactocepin缺失突变株对小鼠巨噬细胞、脾脏细胞、肠上皮细胞以及肠黏液的粘附能力，建立了四种体外粘附模型。实验采取了镜检法、涂板法测乳酸菌对细胞的粘附性，荧光标记法测乳酸菌的体内粘附数。结果显示，lactocepin影响乳酸菌对不同细胞粘附性。在巨噬细胞上，亲本株粘附的数量为27.7±2.52个，lactocepin缺失突变株粘附的数量是19.3±3.06个，明显高于脾脏细胞的19.3±2.08个、10.7±1.53个和小肠上皮细胞的14.7±1.53个、8.3±1.53个，且亲本株对三种细胞的粘附量均显著高于突变株。亲本株对小鼠小肠黏液的粘附率为20.07±0.18％，突变株的粘附率为16.96±0.82％，亲本株显著高于突变株(P＜0.01)。 本试验采用流式细胞仪分析了两株受试乳酸菌在小鼠肠道中的定植与分布。结果表明，亲本株与突变株在肠道中的定植情况不相同。突变株在肠道的定植主要发生在灌胃前期，回肠和结肠中都是在第1d定植量最多，十二指肠和空肠中都是在第3d定植得最多。亲本株在肠道的定植除在结肠是第一天定植量最多以外，都发生在灌胃后期。亲本株和突变株主要都是定植在结肠，十二指肠中最少。在不同肠段，亲本株的粘附量均显著高于突变株(P＜0.01)。 采用CBA技术通过体内、外实验研究了受试乳酸菌对免疫器官、免疫细胞和免疫分子的影响。结果表明，发现亲本株与突变株都能在灌胃的中期提高小鼠的免疫器官指数，后期不明显;均能提高脾脏淋巴细胞转化率，但亲本株比突变株更显著;亲本株能显著提高巨噬细胞能量水平和吞噬能力(P＜0.05)，突变株作用不显著。亲本株和突变株高剂量时均可以增加机体对IFN-α的表达量（P＜0.01），亲本株的表达效果更显著，亲本株可以增加机体对IL-10的表达量(P＜0.01)，而突变株的作用效果不明显。亲本株可以增加机体对IFN-γ的表达量，且与剂量及时间有关，高剂量作用显著(P＜0.05)，突变株作用不明显。两种受试乳酸菌在喂养小鼠的整个阶段均可提高CD11c+ CD80+双阳性细胞的细胞的数量。
副干酪乳杆菌;基因敲除;lactocepin;粘附特性;免疫调节
扬州大学
硕士
营养与食品卫生学
崔桂友;许慧卿
2017
中文
TS201.3;Q78
80
2017-11-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）