分析表达SspH2-EscI融合蛋白的重组沙门菌感染早期小鼠炎症因子分泌及细菌定殖的变化
沙门菌（Salmonella）是引起人食物中毒的主要病源菌之一。其感染后，能够通过调节宿主细胞（如巨噬细胞）功能逃避机体免疫系统的杀伤，从而在细胞内存活。而在感染早期，机体也能够启动天然免疫反应（如分泌炎症因子），以发挥清除作用。因此，分析沙门菌感染早期炎症因子的分泌与沙门菌定殖的关系具有重要意义。本研究首先对流式蛋白定量分析过程进行优化，然后选取了野生型鼠伤寒沙门菌和表达融合蛋白SspH2-EscI的重组鼠伤寒沙门菌为研究对象，探讨其感染早期炎症因子的分泌与细菌定殖的相关性。 1鼠源炎症因子流式蛋白定量试剂盒的优化 利用流式蛋白定量(cytometric bead array, CBA)技术分析细胞因子含量，方法简便、易操作且灵敏度高，但试剂成本较高。本实验以鼠源炎症因子检测试剂盒为参考，分别从降低试剂用量和缩短孵育时间两个方面进行优化，结果表明，试剂用量由50μL降至20μL、孵育时间由2h缩短至30 min仍然可以得到较好的检测效果。以上分析为CBA技术的推广应用提供了重要数据。 2利用CBA技术分析小鼠对沙门菌感染的应答 沙门菌感染后，机体产生应答并分泌细胞因子。本实验利用CBA技术动态分析小鼠对鼠伤寒沙门菌感染（腹腔注射或口服）的应答。结果表明，与未感染组相比，腹腔注射（1×104 CFU/只）或口服（2×107 CFU/只）感染鼠伤寒沙门菌后，小鼠血液凝固加重;血清中炎症因子（IFN-γ、 IL-6、TNF）的分泌呈现先升后降的趋势，该变化与脾脏重量、细菌的体内定殖的变化趋势一致。腹腔注射和口服途径感染具有类似的变化趋势。这说明炎症因子的分泌与细菌的体内定殖呈正相关。 3表达融合蛋白SspH2-EscI的重组沙门菌体外感染巨噬细胞分析 前期研究表明，融合蛋白SspH2-EscI的表达能够增强沙门菌诱导的巨噬细胞内炎性体途径的活化。本实验以含有空载体的重组菌X4550(pYA3334)和表达SspH2的重组菌X4550(pYA3334-P-SspH2)为对照，分析表达融合蛋白SspH2-EscI的重组沙门菌X4550(pYA3334-P-SspH2-EscI)体外感染RAW264.7细胞后的细胞应答情况。结果表明，在感染期间，两对照组的变化趋势相似。与两对照组相比，体外感染(MOI=100)5 h后，X4550(pYA3334-P-SspH2-EscI)感染组细胞膜受损严重，caspase-1的活化和乳酸脱氢酶的释放明显增加，说明细胞内炎性体途径被激活;另外，细胞培养上清中炎症因子的含量在感染期间均呈现下降趋势，而对照组明显不同升高。在细胞代谢方面，各组在细胞内线粒体膜电位、活性氧、NO和钙离子浓度等方面的变化趋势一致，但在pH方面，X4550(pYA3334-P-SspH2-EscI)组在感染5h后细胞内pH值升高，而对照组下降。说明炎性体途径的活化影响了炎症因子的分泌和细胞内pH值的变化。 4表达融合蛋白SspH2-EscI的重组沙门菌感染小鼠分析 据推测，细胞内炎性体途径的活化有利于沙门菌的清除。本研究以含有空载体的重组沙门菌X4550(pYA3334)和表达SspH2蛋白的重组沙门菌X4550(pYA3334-P-SspH2)为对照，通过感染小鼠（腹腔注射和口服），分析表达融合蛋白SspH2-EscI的重组沙门菌X4550(pYA3334-P-SspH2-EscI)在小鼠体内的定殖能力和机体炎症因子分泌情况。结果表明，在感染期间，两对照组呈现相似的变化趋势，小鼠血液凝固加重，血清中炎症因子的分泌增加，脾脏重量升高，细菌定殖严重。而X4550(pYA3334-P-SspH2-EscI)感染组小鼠血液凝固状态、脾脏重量、细菌定殖和炎症因子分泌均明显低于对照组。口服与腹腔注射感染呈现类似的现象。表明，Ssph2-EscI的表达降低了沙门菌的体内定殖和小鼠血清中炎症因子的分泌。
鼠伤寒沙门菌;巨噬细胞;炎症因子;细菌定殖;SspH2-EscI融合蛋白
扬州大学
硕士
营养与食品卫生学
崔桂友;胡茂志
2017
中文
S852.6
76
2017-11-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）