禁食改善小鼠内皮祖细胞介导的缺血性血管新生研究
研究目的: 脑卒中是全球性重大疾病，是致死和致残的主要原因之一;由于脑卒中会导致机体功能性的损伤，给患者及其家庭和社会带来巨大的经济消耗。缺血性脑卒中是由于大脑动脉的栓塞或血栓栓塞，导致脑部的血流量减少，进而导致脑部的缺血损伤。缺血性脑卒中患者的大脑缺血损伤部位病理学上可分为两部分:一部分是不可逆的梗死脑组织区域，另一部分是处于缺血状态但未完全梗死的区域，称为半影区。所有缺血脑卒中治疗的目的都是为了恢复半影区的血流量，通过半影区血液再灌注，抑制缺血进展，减少最终核心梗死区域面积的大小。内皮祖细胞是来源于骨髓的干细胞，在生理或病理因素刺激下，它们可以被招募至缺血损伤部位，促进内皮的再生和新生血管的形成。近年来，干细胞方面的研究提示，细胞治疗有望成为疾病治疗的一种有效手段;而内皮祖细胞移植治疗可能为缺血性脑卒中患者提供新的治疗方案。对于缺血性脑卒中的治疗，除了必要的医疗手段，饮食等生活习惯的干涉也至关重要。最新研究表明，一定程度的禁食可能会产生一系列生理益处。禁食属于热量限制的一种，其方式有间歇性禁食、长时间禁食等。长时间禁食为持续两天及以上的禁食，文献报道可以有效保护正常细胞及器官，帮助对抗各种毒素和毒性环境。我们前期研究发现，长时间禁食（禁食两天）可以改善小鼠的脑缺血损伤，本课题旨在进一步研究禁食改善小鼠脑部缺血损伤的机制，探讨其是否是通过加强内皮祖细胞介导的血管新生实现的。 研究内容及结果: 1.禁食（两天）可显著改善缺血性脑卒中小鼠的内皮祖细胞功能 为了检测禁食是否能够促进缺血性脑卒中小鼠中内皮祖细胞的功能，我们用电凝法凝断小鼠左侧大脑中动脉，制作小鼠缺血性脑卒中模型;模型成功后随机将小鼠分成两组，一组为禁食组，一组为任意饮食组;经过处理后，提取两组小鼠骨髓来源的内皮祖细胞，测试内皮祖细胞的功能;并且测试内皮祖细胞的中的NO和O2-的水平。 结果发现，相比于任意饮食组缺血性脑卒中小鼠的内皮祖细胞，禁食组缺血性脑卒中小鼠的内皮祖细胞的迁移、粘附、小管形成功能均显著增强，禁食组缺血性脑卒中小鼠内皮祖细胞中的NO水平显著提高，O2-水平显著降低。 2.禁食（两天）可显著加强内皮祖细胞移植对缺血性脑卒中小鼠的治疗作用 为了检测功能加强的内皮祖细胞能否改善缺血性脑卒中小鼠的脑部缺血损伤，提取来源于禁食组和任意饮食组小鼠骨髓来源的内皮祖细胞，重新制作一批缺血性脑卒中小鼠模型，将禁食组来源的和任意饮食组来源的内皮祖细胞，通过尾静脉注射移入缺血性脑卒中模型小鼠中，检测内皮祖细胞移植后缺血性脑卒中小鼠第一天和第三天神经行为学变化，以及内皮祖细胞移植后第三天缺血性脑卒中小鼠脑梗体积的大小。 内皮祖细胞移植后第三天检测脑梗体积发现，内皮祖细胞可以显著降低缺血性脑卒中小鼠的脑梗面积，改善缺血性脑卒中小鼠内皮祖细胞移植后第一天与第三天的神经行为学功能，并且禁食组小鼠的内皮祖细胞比任意饮食组小鼠的内皮祖细胞有更强的作用。 3.禁食（两天）可以增强内皮祖细胞对缺血性脑卒中小鼠脑损伤部位血管新生的促进作用 为了检测移植的内皮祖细胞能否归巢于脑部缺血损伤部位，我们提取来源于禁食组和任意饮食组小鼠骨髓来源的EPCs，并通过免疫组化荧光双标实验，用BrdU对内皮祖细胞进行标记，对植入缺血性脑卒中小鼠的内皮祖细胞进行示踪，并且检测缺血性脑卒中小鼠在内皮祖细胞移植治疗后的第三天的血管新生情况。 结果显示，在缺血性脑卒中小鼠脑部缺血部位发现被BrdU标记的内皮祖细胞，并且禁食组来源的标记的内皮祖细胞数目比任意饮食组来源的内皮祖细胞多;BrdU标记的内皮祖细胞与CD31标记的新生血管共处;内皮祖细胞移植治疗三天后发现，禁食组来源的内皮祖细胞治疗后的脑部缺血区域新生血管的数量比任意饮食组的增多，并且有显著差异。 4.禁食（两天）可以增强内皮祖细胞条件培养基对缺血性脑卒中小鼠的治疗作用 内分泌细胞分泌的因子进入组织液，弥散至邻近的靶细胞，调节其机能，此方式称旁分泌。内皮祖细胞的条件培养基是指包含内皮祖细胞旁分泌因子的培养基，在以往的研究中通常用细胞的条件培养基作为工具研究细胞的旁分泌作用。 为了检测内皮祖细胞的旁分泌对缺血性脑卒中小鼠缺血损伤的作用，提取禁食组和任意饮食组小鼠的内皮祖细胞，分别收集内皮祖细胞的条件培养基。将禁食组以及任意饮食组的内皮祖细胞的条件培养基通过尾静脉注射入缺血性脑卒中小鼠中。检测注射一天后，缺血性脑卒中小鼠脑梗体积的大小以及神经行为学变化。 内皮祖细胞条件培养基治疗可以显著减轻小鼠的脑缺血损伤，禁食组来源的内皮祖细胞的条件培养基比任意饮食组小鼠的内皮祖细胞的条件培养基对于缺血性脑卒中小鼠的治疗作用更为显著，脑梗体积显著减少，神经行为学功能改善更显著。 结论: 1.禁食（两天）可以显著改善缺血性脑卒中小鼠中内皮祖细胞的迁移、粘附、小管形成功能。 2.禁食（两天）可以显著加强内皮祖细胞对于缺血性脑卒中小鼠脑部缺血损伤的治疗作用。 3.禁食（两天）可以增强内皮祖细胞对缺血性脑卒中小鼠脑损伤部位血管新生的促进作用。 4.禁食（两天）可以显著增强内皮祖细胞条件培养基对于缺血性脑卒中小鼠的治疗作用。 综上所述，禁食改善缺血性脑卒中小鼠的脑部缺血损伤可能部分与其增强内皮祖细胞介导的缺血性血管新生和加强内皮祖细胞的旁分泌功能有关。
禁食;内皮祖细胞;细胞治疗;血管新生;脑卒中;动物模型
中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学
硕士
药学
张川
2017
中文
R743.2
70
2017-09-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）