核黄素缺乏对HepG2细胞蛋白质表达谱影响的研究
目的:建立核黄素缺乏的细胞模型，用含不同浓度核黄素的培养基培养细胞，观测可使细胞维持正常状态的适宜核黄素水平，用蛋白质组学技术检测核黄素缺乏对HepG2蛋白质表达谱的影响，进一步分析验证蛋白质组学结果，为今后深入研究核黄素缺乏对人体影响的机制提供科学依据。 方法: 1.胎牛血清(FBS)中核黄素的去除:无菌条件下用紫外线照射方法去除FBS中核黄素，采用高效液相色谱(HPLC)法测定经不同照射时间后FBS中核黄素的含量，并用不同照射时间后的血清培养细胞，观测细胞活力。选择使FBS中核黄素显著减少且可维持细胞正常状态的紫外线照射时间，作为进一步模型建立的前处理方法。 2.核黄素缺乏的模型建立与适宜干预浓度探讨:通过定制无核黄素培养基、紫外线清除FBS中核黄素建立核黄素缺乏培养条件，在此基础上，以不同浓度核黄素(0.76、3.76、6.76、12.76、24.76、48.76nmol/L)培养HepG2细胞96小时，期间于不同时间点取样测定细胞活力、细胞凋亡率，于72小时测定培养上清液的丙二醛(MDA)含量、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性，以及细胞中谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)与超氧化物歧化酶(SOD)活性，细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量。 3.蛋白质组学技术检测核黄素缺乏对HepG2细胞蛋白表达谱的影响:运用非标记(label free)定量蛋白质组学技术分析比较在核黄素缺乏(0.76 nmol/L)和核黄素适宜(12.76nmol/L)培养基中培养4天后的HepG2细胞中蛋白质差异表达情况，并进行了生物信息学分析（包括G0富集分析、KEGG通路分析，差异蛋白质互相作用网络分析），然后对筛选出的5个关键差异蛋白(NDUFSl，NDUFV2，SDHA，SQSTM1，ERO1A)进行蛋白免疫印迹(Western bolt)验证。 4.核黄素缺乏对HepG2细胞载脂蛋白B100折叠及其表达通路的影响:因蛋白质组学结果显示核黄素缺乏导致了可能影响载脂蛋白(Apo) B100二硫键折叠的关键蛋白(ERO1A)显著下调，故采用酶联免疫(ELISA)法定量检测细胞内和细胞外分泌ApoB100的含量，用Western bolt和逆转录实时荧光定量(RT-qPCR)技术分别检测核黄素缺乏对ApoB100表达通路基因和蛋白的影响，随后用Ellman法测定细胞中蛋白结合巯基以间接反映ApoB100的二硫键形成情况。 结果: 1.FBS中的核黄素含量随紫外线照射时间的延长而逐渐减少，FBS经照射30min后核黄素含量较未照射组极显著下降，继续延长照射时间核黄素含量下降趋势逐渐减弱;用照射30min血清培养细胞，发现其活力与未照射组无显著差异，而照射时间大于30min的血清组细胞活力显著下降。 2.培养72至96小时，随着核黄素浓度的降低，HepG2细胞活力显著下降、细胞凋亡率显著升高，培养液中AST、ALT活性显著升高、MDA含量显著升高，细胞内GR活性显著下降、而GSH-Px的活性显著上升、GSSG含量显著上升、GSH含量显著降低、GSH/GSSG显著下降。上述大部分指标的核黄素剂量效应拐点在12.76nmol/L左右。证明核黄素缺乏细胞模型建立成功，维持细胞正常状态的核黄素浓度应高于12.76nmol/L。 3.本研究共鉴定到3730个蛋白质，其中在核黄素缺乏组鉴定到2830个蛋白质，在对照组鉴定到3020个蛋白质，即85个蛋白是核黄素缺乏组特有、275个蛋白是对照组特有，在两组共有的2745个蛋白质中经差异性比较后获得37个差异表达倍数大于2的蛋白，其中，与核黄素适宜组相比，核黄素缺乏组有13个蛋白表达显著上调，24个蛋白显著下调。采用GO富集分析发现37个差异蛋白在在线粒体氧化呼吸链有较高富集，分子功能主要为氧化还原活性，主要参与了电子转移，氧化还原，能量代谢等生物学过程，随后采用KEGG信号通路富集分析发现这些差异蛋白主要参与了18个信号通路，其中富集度较高的通路为帕金森病、脂肪酸代谢、内质网应激等信号通路。Western bolt结果显示:与核黄素适宜组相比，核黄素缺乏组的NDUFS1、NDUFV2、SDHA、ERO1A表达显著上调，SQSTM1表达显著下调。验证结果与蛋白质组学结果基本一致。 4.与核黄素适宜组相比，核黄素缺乏组ApoB100细胞内含量及细胞外分泌量均显著下降，二硫键异构酶(PDI)蛋白表达量显著降低、内质网应激标志性蛋白(GRP78，GADD153)表达量显著升高，细胞内总蛋白结合巯基含量显著下降。 结论:核黄素缺乏显著影响人肝癌HepG2细胞的正常状态，维持该细胞状态的培养液中核黄素浓度应高于12.76nmol/L。核黄素缺乏显著影响了HepG2细胞蛋白质表达谱，受影响的相关蛋白可使能量代谢和脂质代谢下调，且可促进内质网应激和凋亡的发生等，进一步针对ApoB100的通路研究发现核黄素缺乏可导致ApoB100二硫键形成障碍从而影响脂质转运。此研究为深入探索核黄素乏对人体影响的分子机制提供线索和实验基础。
核黄素缺乏;蛋白质组;载脂蛋白;细胞模型;天冬氨酸转氨酶;实时荧光定量
广西医科大学
硕士
营养与食品卫生学
郭长江
2017
中文
R591.422
104
2017-09-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）