定向蛋白质组学对乳腺癌中p53-MDM2相互作用的定量研究
在乳腺癌的发展进程中，p53蛋白的抑癌功能可能会受与其相互作用蛋白的影响而减弱。在这些相互作用的蛋白中，MDM2作为一个重要的负性调节蛋白能够抑制p53的转录激活。因此，准确定量并监测在疾病状态下p53-MDM2相互作用的改变情况，能够进一步理解蛋白质与蛋白质相互作用(protein-proteininteraction，PPI)，同时也能为深入研究癌症的发生发展、开发更先进的治疗手段提供参考依据。然而，近年来仅有少部分研究者从事了包括p53-MDM2相互作用在内的关于PPI的定量研究。另外，目前的PPI的研究方法中常常很难同时具有高灵敏度与高特异性的优点。因此，迫切需要发展一种同时具备高灵敏度（低假阴性率）和高特异性（低假阳性率）的PPI定量检测方法。近年来，以液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)为基础的定向蛋白质组学技术凭借其高灵敏度、高选择性以及较宽的动态范围等优点，被广泛应用于分子生物的研究领域。本研究中利用以LC-MS/MS为基础的定向蛋白质组学方法与免疫共沉淀（Co-IP）技术相结合，发展了一种全新的用于p53-MDM2相互作用的定量检测方法。实验结果表明，一种抗原表位在156-214位残基的p53抗体免疫沉淀效果最好。接下来，分别选择了p53蛋白第321-333位氨基酸序列的多肽KPLDGEYFTLQIR以及MDM2蛋白第327-334位氨基酸序列的多肽ENWLPEDK，作为p53和MDM2在定量分析中的特征性肽段，以稳定同位素标记的合成肽段作为内标，实验得到的定量限为2 ng/mL。另外，对乳腺癌细胞样品(MCF-7，MCF-10A)及组织样品（乳腺癌组织，乳腺癌旁组织）中p53蛋白、MDM2蛋白以及p53-MDM2蛋白复合物进行了定量检测，并与蛋白免疫印迹(western blotting)技术得到的结果进行比较。最后，选用了nutlin-3作为PPI的抑制剂，定量检测了在给予nutlin-3抑制剂后，不同时间下MCF-7细胞中p53-MDM2相互作用的变化情况。
乳腺癌;发病机制;p53蛋白;MDM2蛋白;蛋白质-蛋白质相互作用;定向蛋白组学
南京医科大学
硕士
药学
陈芸
2017
中文
R737.9;R730.23
54
2017-09-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）