毛冬青相关有效成分筛选及其抑制磷酸二酯酶活性的研究
目的: 磷酸二酯酶(PDEs)具有水解细胞内第二信使环磷酸腺苷（cAMP）或环磷酸鸟苷(cGMP)的功能，从而终结这些第二信使所传导的生化作用。11种PDE酶家族中的7种PDE酶，已被发现在心脏组织中表达，提示PDE酶在心血管系统病生理过程中的重要作用。近年来，PDE酶作为新的心血管疾病治疗靶点，成为一个新的研究热点。毛冬青作为一个常用中药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒等功效，在冠心病、心绞痛和脉管炎等疾病治疗方面应用广泛。课题组在前期的研究中，发现毛冬青对心血管疾病特别是心衰方面有着良好的药理作用，也有文献表明毛冬青甲素具有PDE酶的抑制活性，然而毛冬青药材的作用基础和可能的靶点等尚未有较系统的揭露。 本文旨在建立一种联合应用超滤技术和液质联用技术的快速筛选方法，对毛冬青中潜在的PDE酶抑制成分进行研究，探讨毛冬青对心血管疾病药理作用的可能机制。 方法: 1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分离与鉴定 毛冬青根粉碎至80目，以80％甲醇超声提取，提取物溶液在高效液相色谱仪中，以乙腈-0.1％甲酸水的流动相体系进行梯度洗脱分离，二极管阵列检测器检测后，在线联用电喷雾离子-离子阱-飞行时间质谱仪进行分析，将所得的色谱和质谱行为数据与文献对照，并对相应的多级质谱碎片进行质谱裂解分析，得到初步的化合物结构解析结果，部分化合物进一步与标准品的色谱保留时间和质谱行为数据进行对照，验证结构鉴定结果。 2.毛冬青根中4种绿原酸类和4中皂苷类成分的含量测定 毛冬青根粉碎至80目，以80％甲醇超声提取，提取物定容为0.05 g·mL-1（以生药计）的供试品溶液。精密称取各对照品，分别加入甲醇配制成含如下浓度的对照品溶液，绿原酸12.5μg·mL-1，异绿原酸B29.6μg·mL-1，异绿原酸A30.0μg·mL-1，异绿原酸C34.5μg·mL-1，毛冬青皂苷B1169.5μg·mL-1，毛冬青皂苷B2130.5μg·mL-1，毛冬青皂苷A1324.0μ g·mL-1，冬青素A728.0μg·mL-1，按比例稀释，绘制各化合物的标准曲线。对照品和供试品在相同的色谱条件下进行测定，以混合对照品溶液进行方法学考察，包括精密度、定量限、检测限等，并对样品的稳定性进行考察，最后测定得到各化合物成分在毛冬青根中的含量。 3.毛冬青根中与PDEⅠ酶结合成分的LC-MS分析 制备浓度为0.1 g·mL-1（以生药计）的毛冬青根提取物溶液，与20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液进行孵育，置于容量4 mL截留分子量为10 kDa的超滤管中进行分离，分离后超滤内管的药物-蛋白复合物以50％甲醇洗脱，收集并以氮气吹干，定容后进行高效液相-二极管阵列检测器-电喷雾离子-离子阱-飞行时间质谱仪联用进行分析，将所得的的色谱和质谱行为数据与毛冬青根提取物的数据进行对照，并对相应的多级质谱碎片进行质谱裂解分析，得到初步的化合物结构解析结果，部分化合物进一步与标准品的色谱保留时间和质谱行为数据进行对照，验证结构鉴定结果。 4.毛冬青根中主要成分与PDEⅠ酶结合的活性研究 制备浓度为0.1 g·mL-1（以生药计）的毛冬青根提取物溶液，分别与浓度为0，10 U·mL-1，20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液进行孵育，后置于容量4mL截留分子量为10kDa的超滤管中进行分离，分离后超滤内管的药物-蛋白复合物以50％甲醇洗脱，收集并以氮气吹干，定容到200μL进行分析。同时，精密称取各对照品，分别加入甲醇配制成含如下浓度的对照品溶液，异绿原酸B10.24μ g·mL-1，异绿原酸A8.96μg·mL-1，异绿原酸C7.84μg·mL-1，毛冬青皂苷B168.8μg·mL-1，毛冬青皂苷B253.6μg·mL-1，毛冬青皂苷A167.2μ g·mL-1，冬青素A475.2μ g·mL-1，按比例稀释，绘制各化合物的标准曲线，并计算得到各化合物在供试品中的浓度。按照色谱峰增强因子的计算公式，计算各有效成分在不同浓度PDEⅠ酶溶液中的富集程度，研究相应的结合活性。 5.毛冬青根中活性成分对PDEⅠ酶的半数抑制浓度(IC50)的测定 毛冬青根中的主要活性成分在不同浓度下与PDEⅠ酶混合孵育，用环核苷磷酸二酯酶活性试剂盒对PDEⅠ酶的活性进行检测，使用多功能酶标仪于620 nm处测定OD值，然后根据标准曲线求出对应的5'-AMP释出量，与空白对照组相比，求得相应浓度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值对1g[药物浓度]作图，用GraphPad Prism5软件进行非线性拟合，求得相应药物的IC50。 6.毛冬青根中活性成分对PDE5A、PDE9A酶的半数抑制浓度(IC50)的测定 毛冬青根中的主要活性成分在不同浓度下分别与PDE5A、PDE9A酶混合孵育，用环核苷磷酸二酯酶活性试剂盒对PDE5A、PDE9A酶的活性进行检测，使用多功能酶标仪于620 nm处测定OD值，然后根据相应的标准曲线求出对应的5'-GMP释出量，与空白对照组相比，求得相应浓度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值对1g[药物浓度]作图，用GraphPad Prism5软件进行非线性拟合，求得相应药物的IC50。 结果: 1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分离与鉴定 在对毛冬青根提取的条件进行优化的基础上，建立了分析毛冬青根中主要成分的HPLC色谱条件;在文献总结、质谱条件优化的基础上，建立了液质联用分析毛冬青根中主要成分的质谱条件。通过对毛冬青根的甲醇提取物进行的分析，分离鉴定出11个化合物，分别为绿原酸、tortosideA、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、3，4，5-三咖啡酰奎宁酸、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。 2.毛冬青药材中4种绿原酸类及4种皂苷的含量测定 建立了HPLC法同时测定毛冬青根中8个成分含量。绿原酸，异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1，冬青素A的质量浓度分别在1.25～12.5、2.96～29.6、3～30、3.45～34.5、13.05～130.5、32.4～324、16.95～169.5、72.8～728μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率（n=9）均高于95％，RSD值均小于3.0％。3批样品测定结果分别为:0.13～0.15、0.23～0.27、0.31～0.37、0.27～0.28、1.24～1.65、2.42～2.86、2.18～2.81、8.29～10.44mg·g-1。方法学验证及3批样品的测定结果表明，该方法简便、准确，适用于同时测定毛冬青根中8个成分的含量测定。 3.毛冬青根中与PDEⅠ酶结合成分的LC-MS分析 应用超滤技术，对毛冬青根提取物中具有与PDEⅠ酶结合活性的主要成分进行富集、分离，并应用HPLC-DAD-IT-TOF-MS联用技术对相关成分进行分析，将所得的化合物的色谱行为和质谱数据与毛冬青根提取物中的数据进行比较分析，鉴定出11个具有PDEⅠ酶结合活性的化合物成分，分别为绿原酸、tortoside A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、3，4，5-三咖啡酰奎宁酸、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。 4.毛冬青根中主要成分与PDEⅠ酶结合的活性研究 应用色谱峰增强因子，对其中7个主要活性成分与PDEⅠ酶结合活性进行分析，初步筛选出可能具有PDEⅠ酶抑制活性的化合物，按照结合活性大小，依次为异绿原酸A＞毛冬青皂苷B2＞异绿原酸C＞冬青素A＞异绿原酸B＞毛冬青皂苷B1＞毛冬青皂苷A1。 5.毛冬青根中活性成分对PDEⅠ酶的半数抑制浓度(IC50)的测定 异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、西地那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A对PDEⅠ酶抑制活性(IC50)分别为779.5μM，1516μM,＞106μM,44.79μM,459.5μM,313.1μ M,158μM,250μM。 6.毛冬青根中活性成分对PDE5A、PDE9A酶的半数抑制浓度(IC50)的测定 异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、西地那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A对PDE5A酶抑制活性(IC50)分别为193.5μ M，436.8μM,＞104μM,0.43μM,1801.7μM,48.8μM,22.4μM,176.6μM;对PDE9A酶抑制活性(IC50)分别为＞104μM，213.7μM，1452μM，2568μM，3944μM，8810μM,＞105μM,4546μM。 结论: 首次建立了一种联合应用超滤技术和液质联用技术对潜在的PDE酶抑制剂进行快速筛选的方法。从毛冬青根甲醇提取物中，分离鉴定出11个具有PDEⅠ酶结合活性的有效成分，弗进一步对其中7个化合物其PDE酶的抑制活性进行了验证。结果显示毛冬青皂苷A1和毛冬青皂苷B2对PDE5A的抑制活性最强，对于了解毛冬青对心血管疾病的良好药理作用提供了一定的依据。同时，这一方法也为从毛冬青及其他中药材中快速筛选潜在的PDE酶抑制剂提供了有效的应用参照。
毛冬青;化学成分;磷酸二酯酶;超滤技术;液质联用;活性筛选
广州中医药大学
博士
中医内科学
冼绍祥
2017
中文
R284
100
2017-09-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）