南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L α-碳酸酐酶(α-CAs)的克隆表达及功能研究
由大气CO2浓度升高而导致的一系列环境问题日益严峻，因此一种环境友好型降低CO2浓度的方法对改善环境非常重要。藻类因其特有的浓缩并吸收CO2进行光合作用的能力，使之在降低大气CO2浓度过程中彰显出其独特的优势。碳酸酐酶作为一种能够催化CO2固定的金属酶，是藻类CCM的重要组分。因此对Chlamydomonas sp.ICE-L CAs的研究变得尤为重要。本论文主要从以下几个方面研究并探讨C.sp.ICE α-CAs的表达及功能: RR1)根据C.sp.ICE-L转录组的4个α-CAs contig，通过分子生物学技术获得α-CAs全基因。生物信息学分析发现这四个α-CAs的序列与已知α-CAs的保守序列及保守His簇一致;亚细胞定位预测α-CA、α-CA2和α-CA4位于叶绿体，α-CA3位于细胞质;系统发育进化树分析进一步表明了这一结果，α-CA、α-CA2和α-CA4与Chlamydomonas reinhardtii chCA聚为一支，α-CA3与C.reinhardtii cyCA聚为一支。 RR2)选取紫外、温度、盐度条件对α-CA进行qRT-PCR分析，发现在相对低的胁迫条件(0 ℃、64‰)下，α-CA表达量相对对照组没有明显的变化，反映出C.sp.ICE-L对逆境的适应性及耐受性;在相对高的胁迫条件(UVB;温度-20℃、10℃;盐度96‰、128‰)下，其mRNA表达量变化显著，说明藻细胞可能通过调节α-CA转录水平的表达量来调节自身代谢，以适应这些不良的环境。 RR3)构建α-CA表达工程菌Transetta (DE3)-pEASY(R)-Blunt E1-α-CA。在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)低温诱导下表达大量α-CA，SDS-PAGE分析Transetta (DE3)-pEASY(R)-Blunt E1-α-CA与Transetta (DE3)-pEASY(R)-Blunt E1的蛋白表达情况。结果表明前者在约40 kDa处有一个明显又较粗的蛋白条带，而后者没有;同时目的蛋白α-CA分子量预测为40.5 kDa。因此可以确定，工程菌成功表达了α-CA。 RR4)通过镍柱亲和层析对杂蛋白样品进行分离纯化，得到较纯的α-CA。分别对其CO2水合酶活性和酯酶活性进行检测，结果表明，CO2水合酶活性试验中酶的比活力为0.437，酯酶活性试验中酶的活性也显著比对照组高。 RR5)这是首次对南极冰藻C.sp.ICE-L中的四个α-CAs全长进行克隆。生物信息学分析初步预测了这四个α-CAs的亚细胞定位，这将有助于进一步了解其各自的功能和作用机理。通过在不同胁迫条件下探究α-CA在转录水平的表达模式，初步发现紫外、温度及盐度胁迫能影响α-CA表达，为明确其在紫外、温度及盐度下通过α-CA的自我调节应答机理奠定基础。首次在原核表达体系中成功表达C.sp.ICE-L的α-CA，并获得了纯度较好、酶学活性较高的蛋白。
冰藻C.sp.ICE-L;α-碳酸酐酶;生物信息学;分子克隆;蛋白表达
国家海洋局第一海洋研究所
硕士
海洋生物学
缪锦来
2017
中文
Q943.2
93
2017-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）