外源水杨酸诱导RNAi与MAPK3级联信号抗番茄黄化曲叶病毒研究
番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）由番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起，严重威胁番茄安全生产。目前番茄抗TYLCV研究主要通过将野生材料中抗性基因、标记渗透到栽培品种中，或者通过RNAi（RNA interference）技术干扰病毒基因序列以达到抑制病毒基因组复制的目的。前者耗时长，抗性不稳定，后者涉及到转基因技术，目前转基因技术还没有被消费者广泛接受。诱导植物抗性为我们提供了一条新思路。诱导抗性是指植物在一些非生物或生物激发子刺激下，对随后病原的侵染产生更快更强的防御反应。植物诱导抗性主要包括两种:一种是诱导系统获得性抗性(ISR)，另外一种是系统获得性抗性(SAR)。ISR抗性途径依赖于茉莉酸(JA)和乙烯(ET)信号。SAR可以通过前期病原侵染，也可以通过化学物质，如水杨酸(SA)或水杨酸衍生物苯丙噻二唑(BTH)诱导植物SAR的发生。因此，我们提出通过SA提高番茄对TYLCV诱导抗性的思路。诱导抗性需要MAPK级联信号系统参与，而植物抗病毒需要RNAi信号参与;MAPK级联信号、RNAi在SA介导抗性中到底发挥什么作用。 本试验通过外源叶面喷施SA，检测番茄植株TYLCV抗性指标，确定SA诱导番茄植株的最适浓度;然后通过最适SA浓度研究RNAi通路关键基因SlDCL2和SlDCL4以及诱导抗性关键基因MAPK3在番茄抗TYLCV防御中的作用，进一步研究它们与SA信号的关系，对SA诱导抗性在抗TYLCV的作用机理做了一定研究，为植物诱导抗性抗病毒提供理论依据。主要结果如下: (1)外源叶面喷施SA提高番茄植株对TYLCV耐性的最适浓度为0.5mM。用不同浓度的SA前处理感病材料‘TTI112B-2’，2天后人工接种TYLCV侵染性克隆，一个月后统计发病率(％)和发病指数。结果显示0.5mM SA前处理植株的发病率(51.1％)和发病指数(29.3)显著低于对照(68.8％，35.7)，进一步研究发现RNAi通路相关基因被诱导表达，TYLCV对植物细胞膜的破坏降低，植物抗氧化能力提高、光合能力增强，植物叶片中病毒的相对含量降低，植株病症减缓，经检测系统性抗性被诱导。 (2)DCL2和DCL4在番茄抗TYLCV防御方面至关重要。利用qRT-PCR技术检测25个RNAi通路基因在抗感材料‘Y19’和‘TTI112B-2’中的差异，结果显示:在抗感病材料中，大多数RNAi相关基因都可以被TYLCV诱导上调表达，但是抗性材料中表达相对较高。通过VIGS技术沉默SlDCL2和SlDCL4，发现抗性材料TYLCV含量增加，病情指数增加，抗性被破坏，而感病材料提前发病，TYLCV含量同样增加。 (3)SA诱导植物对TYLCV抗性需要DCL2和DCL4参与。用0.1mMSA前处理拟南芥dcl2，dcl4和dcl2/4突变体，24h后人工接种TYLCV，14天后qPCR、ELISA和半定量检测TYLCV含量。结果显示SA前处理可以抑制野生型拟南芥Col-中TYLCV的复制，但是不能够降低dcl2、dcl4和dcl2/4突变中的病毒含量。 (4)MAPK3参与调控番茄植株对TYLCV的耐性。TYLCV接种抗性番茄材料‘Y19’，qPCR、ELISA以及Western blot检测结果显示SlMAPK3参与番茄植株的抗TYLCV响应。通过VIGS和植物过表达技术证明MAPK3参与调控SA、JA防御信号通路基因的SlPR1/SlPR2，SlLapA SlPI-Ⅰ/SlPI-Ⅱ表达，提高了番茄植株的抗氧化能力，最终提高了植株对TYLCV的耐性。 (5)SA信号参与TYLCV病原诱导的MAPK3响应。用0.1mM SA前处理SA信号中断突变体npr1，24h后，人工接种接种TYLCV，12h后，Western blot检测MAPK3活性，结果显示野生型Col-中TYLCV诱导的MAPK3磷酸化增幅大于npr1中的。0.1mMSA前处理不能抑制mapk3中TYLCV的复制，但是可以降低野生型Col-中的TYLCV含量。
番茄;抗性育种;黄化曲叶病毒病;水杨酸;RNAi信号通路;分裂原活化蛋白激酶3
西北农林科技大学
博士
蔬菜学
梁燕
2017
中文
S641.2;S603.4
131
2017-08-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）