基于核酸短暂杂交和磁分离技术的单碱基突变检测方法
单核苷酸突变(single-nucleotide mutation，SNM)已被证明与人类的多种疾病相关，因此开发可靠的单核苷酸突变检测方法对于分子诊断和个体化医疗至关重要。由于夹心法低成本和检测速度快的特点，目前广泛应用于核酸生物标志物的检测，然而，在室温下信号探针的杂交特异性差阻碍了突变体和野生体基因的有效区分。本研究以磁珠动态夹心法为基础开发出一种基于信号探针与目标链之间短暂结合的SNM检测方法。这种磁珠动态夹心法(dynamic sandwich assay，DSA)利用DNA短暂结合对单碱基错配敏感的热力学特性，能够在较宽范围的盐离子浓度及室温条件下实现对突变体较高的区分效果。 通过对磁珠粒子表面DNA杂交的研究，发现粒子表面高密度负电荷可以选择性地削弱野生型双链（单碱基错配双链）的稳定性而对突变型双链没有明显影响，因此本研究中使用的磁珠不仅可以作为一种分离工具，还可以提高SNM的选择性;灵活的信号探针设计和简单的磁分离操作使得该方法可以进行多种模式的下游分析，包括比色法检测和等温扩增等。对于比色检测来说，突变体存在下，ABTS-氧化产物呈现典型绿色并在410nm处有较强的吸收，而野生型没有明显变化。DSA基于富含G序列探针的检出限为5nM;对于等温扩增来说，5amol突变体在1h内便能呈现特征扩增曲线，而野生型不显示。DSA基于等温指数扩增的检出限为0.1fM;利用该方法对癌细胞提取基因组DNA中的BRAF D594G(c.1781A＞G)及BRAF V600E(c.1799T＞A)突变基因进行了检测，结果显示在野生型基因存在的情况下实现了0.1％～0.5％的超灵敏低丰度突变检测。
临床诊断;单核苷酸突变;核酸短暂杂交;磁珠动态夹心法
北京化工大学
硕士
药学
喻长远
2017
中文
R446
90
2017-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）