肺炎克雷伯氏菌中聚3-羟基丙酸酯生物合成途径的构建
聚3-羟基丙酸酯(Poly(3-hydroxypropionate)，P3HP)，或称为聚3-羟基丙酸脂肪酸酯，因其能在生物体内不受排斥，且易于降解的性能，成为了石化基塑料潜在的替代品。但这一聚酯材料在生物体内不能自发生成，如何大量生产并将其应用到工业化中的问题诚待解决。本研究旨在人工构建生物代谢途径，通过克隆基因并构建表达载体，于微生物中异源表达酶蛋白，再经廉价碳源进行发酵以生产目标产物P3HP。肺炎克雷伯氏菌生长速度快，遗传背景与大肠杆菌有高度同源性，且对甘油利用率高，能自身合成P3HP代谢途径中间体:3-羟基丙醛和3-羟基丙酸，因此可作为极佳的产聚酯宿主。研究主要包括如下内容: 1、克隆了丙醛脱氢酶基因pduP和PHA合成酶基因phaC;替换pET-PK质粒启动子，得到高效表达载体pET-tac，将其作为骨架串联表达上述两段基因，构建重组载体pET-tac-pduP-phaC及重组工程菌K.p(pET-tac-pduP-phaC);以甘油为唯一碳源摇瓶发酵，气相色谱法检测，证实目的产物P3HP产生，代谢途径构建成功。 2、为提高工程菌产P3HP的能力，对合成途径中聚合步骤的酶基因phaC实施两种优化表达策略，分别构建了拥有两套阅读框架，使串联的基因在表达时互不影响的双启动子重组菌K.p(pET-tac-pduP-tac-phaC);及调换两段基因序列在载体中的顺序以优先表达phaC的重组菌K.p(pET-tac-phaC-pduP)。前者经24h摇瓶培养，生产0.091g/L的P3HP，较原重组菌提高近2倍;经3L培养基上罐发酵48h后P3HP累积达到0.44g/L;SDS-PAGE结果有明显条带，证明异源基因成功表达;后者经摇瓶培养24h后P3HP产量低于原重组菌，仅0.03g/L。荧光定量PCR结果显示，两株优化菌中phaC的转录水平均高于原重组菌，但异源表达酶蛋白还受密码子偏好性等因素制约，实际表达量小，且外源蛋白易降解，最终导致P3HP产量低。 3、克隆来自大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因prpE，串联phaC共表达，得到重组载体pET-tac-phaC-prpE;在载体的Kan片段中插入氯霉素基因Cm，替换原有抗性;以高产3-HP的重组K.pneumoniae为宿主，构建双质粒工程菌K.p(pET-tac-puuC)(pET-tac-phaC-prpE);以甘油为底物发酵，产生的3-HP经丙酰-CoA合成酶和PHA合成酶催化生成P3HP;SDS-PAGE结果显示外源蛋白均有一定程度表达;气相色谱法检测，证实产物存在，P3HP合成途径构建成功。
聚3-羟基丙酸酯;肺炎克雷伯氏菌;生物合成;降解性能
北京化工大学
硕士
药学
田平芳
2017
中文
TQ323.4
98
2017-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）