SlCycB2调控植物多细胞表皮毛形成和花器发育的机制研究
植物表皮毛对抵御生物和非生物逆境具有重要作用，同时也是一种研究植物细胞命运调控的模式系统。拟南芥单细胞表皮毛形成受到MYB/bHLH/WD蛋白复合体的调控，该复合体通过激活下游表皮毛起始关键基因的表达，导致表皮细胞膨大而异化成表皮毛。番茄、烟草等多细胞表皮毛的调控机制不同于单细胞表皮毛。到目前为止，番茄、烟草等多细胞表皮毛的形成机制尚未被揭示。表皮毛的形成离不开细胞周期的调控，细胞周期蛋白在不同细胞周期的转变过程中起到重要作用。花器官发育的研究具有重要的生物学意义，目前确定ABCDE模型可以用来揭示花器官形成调控机理。但是，本研究中的新型B型细胞周期蛋白是否参与花器官形成的调控还未可知。 本研究主要对SlCycB2基因在番茄、烟草和拟南芥中的同源基因进行了鉴定，并在番茄和烟草中进行了功能分析。主要的结果如下: 1.利用SlCycB2基因编码的氨基酸序列在SGN、TAIR和NCBI等数据库中筛选同源基因。在番茄中确定2个同源基因，命名为SlCycB3和SlCycB4;在烟草中确定3个同源基因，分别命名为NtCycB2、NtCycB3和NtCycB4;在拟南芥中确定2个同源基因，命名为AtCycB2和AtCycB3。一级结构分析发现这类基因均只有一个外显子，编码100多个氨基酸，具有三个保守区。将该类基因与番茄、烟草和拟南芥中的功能已知的B型细胞周期蛋白进行系统进化树分析，结果显示它们是一类新型的B型细胞周期蛋白。 2.利用番茄、烟草和拟南芥中SlCycB2的同源基因所编码氨基酸序列在NCBI中进行Protein Blast分析，确定不同物种均含有SlCycB2的同源基因，且功能未知。该结果表明SlCycB2基因以及在不同物种的同源基因可能具有重要的生物学功能。 3.SlCycB2和SlCycB3的组织表达谱分析结果显示这两个基因在番茄各个组织中都有表达，在花和叶中的表达最高。亚细胞定位分析确定SlCycB2所编码蛋白定位于细胞核中。SlCycB2基因启动子序列分析发现其中有多个光响应元件。对栽培番茄Ailsa Craig进行光照和暗处理，测定SlCycB2和SlCycB3基因的表达量，结果显示二者均受到光的诱导，受到暗条件的抑制。构建SlCycB2基因启动子驱动GUS-YFP融合表达载体，转化番茄并分析该基因的表达特点，实验结果表明该基因在下胚轴、茎表皮毛、叶表皮毛、花中的柱头和未成熟的果实中都有表达，且在表皮毛的腺体中高表达。 4.转基因功能分析确定SlCycB2基因参与调控番茄表皮毛的形成。SlCycB2超量表达载体和RNAi抑制表达载体分别导入到栽培番茄AC获得转基因植株。qRT-PCR分析结果显示SlCycB2基因的表达水平在超量表达转基因植株中显著上调，而在抑制表达转基因植株中显著下调。SlCycB2超量表达植株中表皮毛密度显著减少，非腺体毛和Ⅰ型腺体毛几乎消失，Ⅵ和Ⅶ型腺体毛的密度显著降低。而在SlCycB2-RNAi抑制表达植株上表皮毛密度显著增加，且主要是Ⅲ型和Ⅴ型非腺体毛显著增加，而且茎上形成了Ⅲtype-like超长毛，其他类型的表皮毛没有明显变化。 5.SlCycB2超量表达植株叶片萜类含量的测定结果显示与对照AC相比，SlCycB2超量表达植株叶片中萜类化合物（包括单萜和倍半萜）的含量极显著降低。萜类化合物对生物具有重要的防御作用。因此，分析了转基因材料对斜纹夜蛾的抗性实验，结果表明SlCycB2超量表达植株更易遭受斜纹夜蛾的啃食。综合这些结果，推测SlCycB2基因可能通过调控Ⅵ型表皮毛的形成，影响萜类物质的生物合成，进而影响其生物防御的效果。 6.转基因功能分析还表明SlCycB2基因调控番茄花器官的发育。SlCycB2超量表达植株表现出花药开裂，花柱变短的表型，坐果率显著降低。SEM观察发现畸形花粉显著增加，花柱细胞变短和柱头乳突细胞畸形。实验结果表明SlCycB2参与调控番茄花柱和花粉的发育。 7.RNA-seq分析结果表明，SlCycB2超量表达植株和对照AC植株之间具有241个差异表达基因(DEGs); SlCycB2-RNAi抑制表达植株和对照AC之间有84个差异表达的基因;SlCycB2超量表达植株和SlCycB2 RNAi植株之间有834个差异表达基因。对DEGs进行功能聚类分析，发现这些DEGs主要参与萜类代谢、角质蜡质合成和蛋白酶抑制因子的合成等途径。这暗示了SlCycB2超量表达植物中次生代谢物（如萜类化合物）的减少导致其对食草性昆虫的防御力减弱。 8.转基因分析结果显示SlCycB2在不同物种的同源基因具有相同的多细胞表皮毛调控功能。利用pMV2载体构建了SlCycB3、SlCycB4、NtCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3基因的超量表达载体，利用pHELLSGATE2构建了SlCycB3和SlCycB4的RNAi抑制表达载体，遗传转化获得转基因植株。利用qRT-PCR和RT-PCR检测目的基因的表达水平，确定这几个基因在超量表达植株中均上调表达;SlCycB3和SlCycB4在RNAi抑制表达植株中均下调表达。表型分析发现SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2超量表达转基因植株的表皮毛密度显著减少;SlCycB3-RNAi抑制表达植株的表皮毛密度显著增加，说明这类基因具有相同的多细胞表皮毛调控功能。 9.SlCycB2、SlCycB3、NtCycB2和AtCycB2超量表达番茄植株中SlCycB2和SlCycB3的表达量进行测定，结果显示在NtCycB2和AtCycB2超量表达转基因番茄植株中SlCycB2和SlCycB3基因都下调表达;在SlCycB3超量表达番茄植株中SlCycB2基因亦下调表达;同样，在SlCycB2超量表达植株中SlCycB3也下调表达。推测这类基因可能受其同源基因的表达水平的影响。 10.构建的SlCycB3、SlCycB4、tCycB2、NtCycB3、NtCycB4、AtCycB2和AtCycB3超量表达载体遗传转化烟草获得转基因植株。表型分析确定SlCycB2、SlCycB3、AtCycB2和NtCycB2转基因植株的表皮毛密度显著降低，而SlCycB4、AtCycB2、NtCycB3和NtCycB4转基因植株的表型没有变化。SEM观察发现SlCycB2和AtCycB2转基因植株中长柄和短柄腺体毛密度都显著减少。因此推测茄科作物可能具有相似的多细胞表皮毛调控途经。
番茄;表皮毛;花器官形成;SlCycB2调控;基因鉴定;进化树分析
华中农业大学
博士
蔬菜学
叶志彪
2017
中文
S641.2;Q756
115
2017-08-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）