维医异常胆液质证与溃疡性结肠炎大鼠模型的组学研究
目的: 本研究论文主要选择维医异常胆液质证模型大鼠与TNBS-乙醇灌肠液诱导的溃疡性结肠炎模型大鼠为研究对象，通过分析大鼠一般体征、下丘脑及结肠组织形态学结构变化;通过代谢组学分析下丘脑、结肠代谢组份差异;通过RNA-Seq测序技术研究下丘脑、结肠转录谱差异;通过研究甲状腺激素异常对异常胆液质证与UC大鼠代谢紊乱产生的作用，综合分析异常胆液质证形成及其诱发UC的物质基础。 方法: 1）采用干热饲养环境、干热属性饲料（黑胡椒、干姜、西红花）、夹尾、噪音等多因素复合刺激，建立异常胆液质证载体动物模型。通过TNBS乙醇液灌肠复制大鼠溃疡性结肠炎模型，观察大鼠生物表型改变及组织形态学改变; 2）利用核磁共振技术检测多因素复合诱导的异常胆液质证、UC大鼠模型中下丘脑和结肠代谢产物的变化; 3）应用RNA-seq全面分析异常胆液质证和UC大鼠下丘脑和结肠组织的转录本，筛选出差异表达基因。第二，应用GO方法进行差异基因的功能聚类，应用KEGG信号通路富集差异表达基因相关的信号通路。第三，构建蛋白质相互作用网络，分析差异表达基因之间的相互作用，筛选出重要的差异表达基因。第四，应用实时荧光定量PCR方法验证差异基因的表达水平; 4）检测血清中甲状腺功能7项指标及血清糖脂代谢相关生化指标，通过相关性分析，分析甲状腺激素水平与异常胆液质证及溃疡性结肠炎形成中对代谢的影响。同时通过血清代谢组学的结果绘制代谢的整体网络调控图。 结果: 1）通过多因素复合造模方法成功模拟出了符合人体异常胆液质证临床表现的证候模型以及成功复制了TNBS-UC模型。肉眼观察异常胆液质证结肠组织出现轻微充血，HE染色后镜下观察，发现异常胆液质证组出现少量炎细胞浸润。异常胆液质证组下丘脑镜下出现脑血管扩张充血，血管周围间隙增宽，部分神经细胞形态变圆。UC组结肠肉眼可见肠壁坏死充血水肿现象，部分深大溃疡表面有黑褐色膜状物附着，周边肠黏膜充血、水肿明显，病变部位肠壁明显增厚，管壁僵硬。HE染色后镜下可见黏膜上皮细胞变性坏死，黏膜固有层，黏膜下层大量中性粒细胞浸润伴纤维素渗出及片状出血，符合急性炎症的组织病理学改变，与人类UC急性期改变相似。UC模型组下丘脑镜下出现脑血管扩张充血，血管周围间隙增宽，部分神经细胞形态变圆; 2）下丘脑代谢组学研究结果显示异常胆液质证组显著性高峰度代谢物为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙醇、γ-氨基丁酸、N-乙酰天冬氨酸、胆碱和肌醇，显著性低峰度代谢物为谷氨酸和牛磺酸。UC组具有显著性高峰度代谢物为:乙醇，γ-氨基丁酸，N-乙酰天冬氨酸，乳酸，苯丙氨酸。通过对样本间进行RNA-Seq分析，发现异常胆液质证大鼠在下丘脑中大量的通路与神经信号通路相关，如“Neuroactive ligand-receptor interaction”，“Cocaine addiction”，“Amphetamine addiction”，“Serotonergic synapse”，“dopaminergic synapse”等。UC组在丘脑组织中上调表达的基因富集到“Adipocytokine signaling pathway”、“Calciumsignaling pathway”、“Tyrosine metabolism”、“Cytokine-cytokine receptor interaction”、“PI3K-Akt signaling pathway”等通路。异常胆液质证组和UC组差异基因共表达分析，发现2条和甲状腺激素应答相关通路，分别是“Thyroid hormone synthesis”、“Autoimmune thyroid disease”，差异表达基因为Cga，Tshb。结合GO-蛋白网络图和基因通路网络图，找到四个共同上调基因，分别是Pmch、Cga、Tshb和Hcrt; 3）结肠代谢组学分析显示异常胆液质证组具有显著性高峰度代谢物为:3-羟基丁酸，乳酸，琥珀酸，ATP/ADP。异常胆液质证组具有显著性低峰度代谢物为:GSH，甘油磷酸胆碱，肌醇。UC组的差异代谢物结果显示，和正常组对比，UC组结肠具有显著性高峰度代谢物为:丁酸，丙酸，乙醇，3-羟基丁酸，乙酸，琥珀酸，甲胺，二甲胺，丙二酸，葡萄糖，糖原。UC组具有显著性低峰度代谢物为:丙氨酸，谷氨酰胺，谷胱甘肽，甘油磷酸胆碱，肌醇，磷酸肌酸，牛磺酸，肌酐。结肠组织获得差异表达基因通过GO和KEGG分析，发现在异常胆液质证组结肠出现了炎症、免疫相关通路基因表达下调，而UC组炎症、免疫相关通路基因表达上调的现象。将异常胆液质证与UC组取并集，运用WGCNA进行分析，选择在正常组和异常胆液质证组低表达，UC组高表达的module进行KEGG通路分析，得到的大部分功能通路与免疫相关，如“Cytokine-cytokine receptor interaction”,“TNF signaling pathway”,“PI3K-Aktsignaling pathway”，“NF-kappa B signaling pathway”等信号通路，同时也发现2条甲状腺激素相关的通路，筛选甲状腺激素主要信号通路，通过基因间的相互作用网路关系图，发现Tnf是其中的核心分子。通过Thrsp基因做共表达分析，发现糖异生关键酶PCK1、FBP的下调和GK上调。同时糖酵解途径中PKLR和GPD1出现下调，脂肪酸β-氧化中脂酰CoA脱氢酶(Acadsb)基因表达却上调，谷胱甘肽S转移酶和谷氨酸-半胱氨酸连接酶均下调; 4）血清中T3、T4、FT3、FT4水平在异常胆液质证组和UC组均降低，异常胆液质证组虽然降低，但仍然处在正常范围内，UC组明显低于正常水平。血糖、果糖胺、甘油三酯、载脂蛋白B在UC组中显著升高，高密度脂蛋白显著降低，(P＜0.05)。甲状腺激素与葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇存在负相关，与高密度胆固醇正相关。异常胆液质证组最终确定大鼠血清中有13种的差异性代谢成分，其中异常胆液质证组中显著升高的代谢物为:异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙酮酸、肉碱、β-羟丁酸、乳酸、肌酸，显著降低的代谢物为:VLDL、瓜氨酸、酪氨酸。和正常组比较后，UC组中共找到13种差异代谢物，在UC组中显著升高的代谢物为:LDL、乳酸、肌酸，UC组中显著降低的代谢物为:亮氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、丙氨酸、肉碱、柠檬酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、甲基组氨酸。 结论: 1）通过干热属性饲料，干热环境喂养，夹尾、噪音、慢性足底电刺激多因素复合方法造模，大鼠出现了出现情绪易激动、喜打斗、舌苔发黄、尿色黄、粪便于硬、体重减轻、饮水、饮食量增加的现象。成功模拟出了符合人体异常胆液质证临床表现的证候模型。成功复制TNBS乙醇液灌肠诱导大鼠溃疡性炎症的发生。模型中结肠组织出现了与人类UC急性期相似的病理改变; 2）下丘脑神经递质分泌异常，膜稳定性破坏及能量代谢异常是异常胆液质证组与UC组中的共同表现。TSH编码基因Cga和Tshb表达上调，可能是异常胆液质证组和UC组下丘脑对刺激的应答反应，在异常胆液质证和UC形成过成中都起到非常关键的作用，推测在异常胆液质证诱发UC过程中发挥重要作用; 3）结肠组织出现的能量代谢失衡、氧化抗氧化体系平衡紊乱、细胞膜稳定性破坏是导致溃疡性结肠炎发生的主要因素，同时也是异常胆液质证诱发UC的主要原因。TNF-α一方面通过抑制GSH活性使结肠细胞产生氧化损伤，另一方面做为促炎细胞因子，通过激活和放大的双重作用，以DAG-PKC-NF-κB信号传导途径激活而产生炎症反应，在UC形成中起重要作用; 4）血清甲状腺激素含量降低是异常胆液质证组与UC组发生的共同物质基础。异常胆液质证与UC形成过程中，神经内分泌系统和免疫系统相互作用，一方面免疫系统通过细胞因子(TNF)作用于神经-内分泌系统，使神经-内分泌系统激素释放异常（甲状腺激素含量降低），另一方面甲状腺激素又作用于全身，使整体代谢发生改变如抑制糖代谢，促进脂类分解，使能量失衡，并产生全身免疫紊乱使结肠受到损伤。异常胆液质证组血清甲状腺激素含量偏低但仍处于正常范围，是异常胆液质证处于亚健康状态的主要原因，也是异常胆液质证诱发UC的原因之一。
异常胆液质证;溃疡性结肠炎;代谢组学;测序技术;甲状腺激素
新疆医科大学
博士
药理学
库热西·玉努斯
2016
中文
R575;R574.62
156
2017-04-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）