白桦鲨烯合酶和鲨烯环氧酶基因的克隆及表达特性研究
白桦三萜具有重要的抗肿瘤和艾滋病毒活性，而白桦三萜重要活性成分（白桦脂醇、齐墩果酸、达玛烯二醇等）和固醇均来自甲羟戊酸代谢途径中共同的前体物质2，3-氧化角鲨烯。鲨烯合酶(Squalene synthase，SS)和鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase，SE)是直接参与合成2，3-氧化角鲨烯的两个关键酶，为三萜代谢途径中的重要节点，SS和SE的含量和活性对三萜的合成与积累起着重要的调控作用。本研究以白桦（BetulaPlatyphlla suk）为试材，克隆白桦三萜合成途径关键酶BpSS和BpSE基因全长及启动子序列，并进行生物信息学分析;检测了不同激素及不同组织中BpSS和BpSE表达模式;同时分别构建了BpSS和BpSE的植物和酵母表达载体，对其在白桦和酵母中的表达特性进行研究，并完成基因定位。以期为为通过基因工程技术及合成生物学途径促进白桦三萜高效合成奠定基础，为白桦三萜类物质的生物技术利用提供理论依据和技术支持。 本研究结果如下: 1.以白桦组培苗RNA反转录cDNA为模板，应用RACE技术克隆获得白桦的鲨烯合酶BpSS和鲨烯环氧酶BpSE基因的cDNA全长，生物信息学分析表明，BpSS基因cDNA全长为1588bp，ORF为1242 bp，编码413个氨基酸，有一个特异的Isoprenoid_Biosyn_C1超家族，包含Trans-IPPS HH结构域，并与大豆、甘草等物种SS的氨基酸序列相似性达85～88％，具有高度同源性。系统进化树分析显示，白桦的SS与可可树的SS1同源性较高，属于一个分支，次之是豆科的甘草和大豆等，再次之是毛果杨。白桦的SE基因cDNA全长为2040bp，ORF长为1581 bp，编码526个氨基酸，在第209～428 aa位置具有一个SDR超家族，包含特异的鲨烯环氧酶结构域(SE)保守区和辅酶Q结合域(COQ6)，与可可、麻风树等物种SE的氨基酸序列相似性达82～88％。系统进化树表明，白桦的SE与南非醉茄、毛曼陀罗的同源性较高，属于一个分支，与其他植物、动物和人的进化距离依次渐远。 2.利用实时定量RT-PCR技术，分析了不同组织中以及不同植物激素诱导下BpSS和BpSE基因的表达模式，结果表明，BpSS和BpSE基因均存在组织表达特异性，且表达特征相似，均为叶＞茎＞根。MeJA(100μM)、乙烯(5mM)和ABA（10μM）不同程度诱导了BpSS和BpSE的表达。BpSS和BpSE的表达对SA(50 mg/L)响应不显著。构建高效植物表达载体pCAMBIA1303-BpSS采用三亲杂交的方法，通过瞬时转化技术，将BpSS-GFP融合蛋白转化到洋葱表皮细胞使其瞬时表达，结果显示，在细胞质中发出绿色荧光，表明BpSS蛋白的表达定位于细胞质中。 3.利用基因组步移技术，克隆获得长度为965bp、1193bp的BpSS和BpSE基因的启动子序列软件分析显示，两个基因启动子区域包含多种激素和逆境响应相关的瞬时作用元件，包括茉莉酸响应元件CGTCA-motif,赤霉素响应元件GARE-motif,生长素响应元件TGA-element，逆境响应元件TC-rich repeats等，及转录因子bHLH结合位点G-box调控元件和转录因子MYB结合位点MBS元件。 4.利用pYES2分别构建BpSS和BpSE酵母表达载体，将重组质粒pYES2-BpSS和pYES2-BpSE转化酿酒酵母INVScl，比较重组和非重组酵母在萜类合成产物和酶的活性。结果显示，重组酵母菌pYES2-BpSS和对照酵母菌（未转化）分别诱导培养（半乳糖诱导基因表达）12h，HPLC检测鲨烯含量结果显示。诱导12h后的重组酵母菌鲨烯的含量（0.466 mg/g）为对照酵母菌含量（0.0338mg/g）的13.2倍。重组酵母pYES2-BpSE和对照酵母菌的鲨烯环氧酶活性分析显示，诱导表达的重组酵母INVScl(pYES2-BpSE)酶活性为0.2314pkat/g是对照酵母INVScl(pYES2)的11.84倍。
三萜类化合物;合成工艺;鲨烯合酶基因;鲨烯环氧化酶基因;基因克隆;基因表达;药用作用
东北林业大学
硕士
森林生物工程
尹静
2016
中文
TQ464.2
89
2017-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）