L型钙离子通道阻滞剂贝尼地平对C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的体内外研究
目的： 贝尼地平作为临床上常用的降血压药物，其主要机制是通过调控血管平滑肌细胞上的L型钙离子通道的开闭，进而调控平滑肌的收缩舒张，最终调控全身血压。作为抗高血压的常用药物，贝尼地平具有持续干预的潜力。此外，目前贝尼地平对骨代谢的在体作用仍不明了，因此，本实验通过观察贝尼地平对BMSC的成骨分化影响，以及贝尼地平灌胃去卵巢C57/BL骨质疏松模型小鼠来探讨钙离子通道阻滞剂对骨代谢的作用及机制。 方法： 1.材料:取原代BMSCs所用的雌性4周大C57/BL6小鼠，体重10～15g，购至内蒙古农业大学实验动物中心;主要实验仪器与试剂:(1)主要仪器:倒置光学显微镜(Nikon，TE2000-U)，(2)主要试剂:一抗Runx2（CST公司），一抗OCN（CST公司），一抗GAPDH（CST公司），一抗β-catenin（CST公司），一抗LRP5（CST公司），ALP染色试剂盒（碧云天生物试剂公司），Caspase-8比色测定工具包（凯基生物公司），贝尼地平（Sigma公司），α-MEM（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司）。 2.BMSCs的提取与培养 小鼠寰枢椎脱臼处死后75％酒精浸泡消毒5分钟，在超净台中用眼科剪和眼科镊剥开小鼠皮肤，从髋臼关节处取下小鼠双下肢，PBS清洗掉粘连毛发，剥离附属肌肉等软组织整理出股骨，浸泡于α-MEM基础培养基中，用一套新的灭菌眼科剪和眼科镊剪开股骨双侧骨端暴露骨髓腔，用1 ML注射器吸取10％FBS的完全培养基冲出骨髓，反复并两端交换冲洗，待骨头发白后将含有骨髓的完全培养基转移至干净的15 ML离心管，800 r/min低速离心5分钟，骨髓重悬后转移至10 cm培养皿中5％的CO2下37℃培养，培养基3天更换1次。 3.细胞实验的分组与处理 取第3代生长良好的小鼠BMSCs按1×105个/孔密度接种于6孔板，待细胞融合率达到90％以上时，将细胞分为2组，对照组:成骨诱导培养基培养;贝尼地平处理组:成骨诱导培养基条件下分别以1、10和100μmol/L贝尼地平培养。成骨诱导培养基各成分比例为100 nmol/L的地塞米松，50μg/ml的维生素C磷酸酯，10 mM/L的β-甘油磷酸钠。药物连续处理14天，3天更换1次培养基，37℃，5％CO2条件下培养。 4.CCK8检测贝尼地平对BMSCs的细胞毒性 第3代BMSCs种于96孔板中，细胞的种植密度为1×105个/孔，培养2天后对细胞进行加药处理，加入贝尼地平浓度分别为0.1、1、10、100和1000μmol/L，加药处理1天，使用Caspase-8比色测定工具包(CCK8)进行药物细胞毒性检测。每孔加入10μL的CCK8溶液和90μL的α-MEM基础培养基，使用酶标仪测量各孔吸光度（optical density, OD），CCK8溶液吸收波长为450 nm。 5.ALP染色实验 第3代BMSCs种于6孔板中，细胞成骨诱导并加入贝尼地平（1～100μmol/L）处理14天后，对细胞行ALP染色。具体步骤为:洗去细胞培养基，使用无菌PBS轻柔冲洗2次，每孔加入2 ml的4％多聚甲醛室温固定20分钟;PBS冲洗3次，每次3分钟，洗掉多余多聚甲醛;按照使用说明书配制ALP染液，现配现用，配好ALP染液避光保存;每孔细胞加入ALP染液1 ML避光37℃孵育半小时;PBS冲洗3遍，每遍3分钟，终止染色。光镜下拍照，Image-Pro Plussoftware（IPP，美国）软件计数阳性细胞数。 6.Western blotting检测Runx2、OCN、GAPDH、β-catenin和LRP5的表达水平 对细胞成骨诱导并加入贝尼地平（1～100μmol/L）处理14天后，在冰上用蛋白裂解缓冲液裂解细胞，收集蛋白，样品金属浴96℃处理10分钟，10000 r/min高速离心1分钟，取上清，-20℃长期储存备用。每条泳道上样30μg蛋白，用体积分数(V/V)为10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳60分钟，将凝胶中蛋白电泳转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉常温封闭1小时后分别加入一抗(1∶2000)冰箱4℃过夜孵育，室温TBST溶液清洗3遍，每遍5分钟，二抗(1∶3000)常温孵育1小时，增强化学发光(ECL)发光试剂显色摄像。条带用Image J软件分析，测定灰度值。目的条带与对应的GAPDH条带灰度比值为统计结果。 结果： 1.BD对BMSCs的细胞毒性影响 加药处理1天后，对细胞行CCK8检测，结果提示BD浓度在1～100.μmol/L时对细胞均不会出现毒性作用(p＞0.05)，各实验组（1～100μmol/L）CCK8结果和对照组相比差异无统计学意义（p＞0.05，图1，表1）。 2.BD对BMSCs的ALP表达影响 细胞处理14天后，行ALP染色，光镜下拍照用IPP软件计阳性细胞数。对照组:88.93183±13.84093，1μmol/L组:120.2671±24.90133，10μmol/L组:133.6373±20.98523，100μmol/L组:174.4387±15.34316，各组组间比较差异具有统计学意义（p＜0.05，图2，表1），随着BD浓度的增加，ALP阳性细胞数相应明显增加，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 3.BD对BMSCs的Runx2和OCN表达影响 细胞处理14天后行蛋白免疫印迹检测Runx2表达量，对照组:1.054064±0.1719727，1μmol/L组:1.634447±0.1609285，10μmol/L组:2.116751±0.2348296，100μmol/L组:2.924276±0.1659721，各组组间比较差异具有统计学意义（p＜0.05，图3，表1），随着BD浓度的增加，Runx2表达相应明显增加，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 4.BD对股骨下段生长板周围骨小梁的组织学影响 股骨下段行HE染色（图1）发现，BD能明显抑制由于去卵巢引起的骨质疏松。和单纯去卵巢组（图1，表1）小鼠的股骨下段生长板周围骨小梁相比，去卵巢加药组小鼠的骨小梁数量明显增加，差异具有统计学意义(p＜0.05)，但仍然低于假手术组小鼠（图1，表1），差异具有统计学意义(p＜0.05)。 5.BD对股骨下段骨代谢参数的影响 股骨下段显微CT扫描（图2）发现，和去卵巢加药组小鼠（图2，表1）相比，去卵巢组小鼠的BMD、Tb.Th、Tb.N均明显降低，差异具有统计学意义(p＜0.05);而各组中假手术组（图2，表1）的BMD、Tb.Th和Tb.N最高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 6.BD对WNT/β-catenin信号通路影响 细胞处理14天后行蛋白免疫印迹检测β-catenin表达量，对照组:1.014551±0.0531498，1μmol/L组:2.090139±0.1359573，10μmol/L组:3.444125±0.4555160，100μmol/L组:4.381943±0.4081259，各组组间比较差异具有统计学意义（p＜0.05，图4，表1），随着BD浓度的增加，β-catenin表达相应明显增加，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 结论： 1.本研究首先通过酶标仪法检测贝尼地平对骨髓基质干细胞的毒性作用，在实验设置的贝尼地平浓度范围内（1～100μmol/L）未发现骨髓间充质干细胞出现毒性反应(p＞0.05)。 2.贝尼地平对成骨细胞中碱性磷酸酶的表达具有明显促进作用。贝尼地平通过促进成骨细胞中关键转录因子Runx2的表达进而促进成骨细胞分化进程。β-catenin和LRP5作为WNT/β-catenin信号通路内关键正性调控蛋白，其表达量的上调提示WNT/β-catenin信号通路强度明显增强，从信号通路方面阐述贝尼地平促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的机制。 3.本验通过去卵巢模仿绝经期后妇女骨质疏松模型，发现在体内环境下，贝尼地平具有对抗雌激素水平下降的骨质疏松作用。本课题对股骨下段石蜡切片进行了成骨关键蛋白OCN和重要转录因子RUNX2免疫荧光以及免疫组织化学检测，发现贝尼地平体内通过成骨重要转录因子RUNX2促进成骨，在分子生物学水平上揭示了贝尼地平促进成骨的机制。 4.贝尼地平作为临床上常用的心血管药物，其降血压特性已得到广泛运用，国外已有部分研究报道贝尼地平对成骨细胞的促进作用。在此背景下，本研究以骨髓基质干细胞为研究切入点，从成骨细胞的祖细胞水平在体外环境下探讨贝尼地平对骨代谢的具体作用，并阐述了本过程的信号通路机制，为临床上贝尼地平的全新运用提供实验依据。临床上骨质疏松症作为骨代谢异常最常见的病症，为家庭了社会带来了沉重负担，另外，高血压合并骨质疏松在临床上也较为常见，绝经期后妇女在卵巢功能明显衰退阶段，骨量的丢失导致骨折风险增加，以上种种因素均促使临床工作者寻找对抗高血压和骨质疏松的良好方法，本实验希望对此艰巨任务提供一些基础实验依据，但贝尼地平在体促进成骨的深沉及时需要进一步探讨。
贝尼地平;骨髓间充质干细胞;成骨分化;骨代谢;信号通路
南方医科大学
博士
骨外科学
蔡道章
2016
中文
R972
104
2017-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）