乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响
研究旨在探讨LF对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响，以及LF对经LPS刺激的人牙周膜细胞成骨分化的影响，初步探索LF在促进牙周组织修复方面的作用，为临床上新的牙周病治疗方法提供理论依据。 第一章:人牙周膜细胞的体外培养和鉴定 目的: 体外培养人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs），观察体外培养的人牙周膜细胞的形态特征及其鉴定。 方法: 1.取15～22岁因正畸需要拔除的健康前磨牙，要求牙体牙周牙髓健康，拔出时无污染。 2.免疫组化SP（streptavidin-perosidase）法抗波形丝蛋白、角蛋白染色。 3.取第3代hPDLCs，消化成密度为1×106 mL-1的细胞悬液，分别加入小鼠抗人CD29、CD44、CD105、CD90单抗，室温孵育1h;洗涤后加入羊抗鼠Ig-FITC，室温下避光45min;洗涤后弃上清，加PBS重悬，流式细胞仪检测细胞分子表型。 4.MTT法检测hPDLCs活性。 5.茜素红染色法检测hPDLCs的矿化能力。 结果: 1.组织块酶消化法分离培养hPDLCs成活率较高。 2.SP法抗波形丝蛋白、角蛋白染色结果显示，波形丝蛋白染色后细胞质深染，显阳性;角蛋白染色胞质浅染，为阴性。 3.流式细胞仪分析hPDLCs分子表型显示:CD29、CD44、CD90、CD105标志的阳性细胞率分别为98.17％、99.13％、100％和78.21％，与结果2共同表明所培养细胞为间充质来源。 4.hPDLCs接种第3d细胞增长迅速，进入对数生长期，第5～7d处于平台期，符合成纤维细胞生长规律。 5.矿化诱导14d的hPDLCs，茜素红染色后显微镜下可见若干大小不等的红褐色结节形成。 第二章:乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖、迁移的影响 目的: 采用MTT法、划痕实验、Transwell法分别检测乳铁蛋白对hPDLCs增殖、迁移的影响，探讨乳铁蛋白是否能够促进hPDLCs的增殖和迁移。 方法: 1.人牙周膜细胞的培养同第一章。 2.将第3代HPDLCs按5×104mL-1的密度接种至96孔板，同时将培养基更换为含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL LF的完全培养基，按培养及成分不同分组，每组6个复孔，分别在接种后的第1d、3d、5d、7d进行MTT检测。 3.取第3代生长良好的hPDLCs，以5×104mL-1接种于6孔板，待细胞长至80％～90％后，用200μL规格枪头沿尺子在6孔板底部划出1mm宽划痕，并标记观测点。 4.取第3代生长良好的hPDLCs，以5×104mL-1密度接种至Transwell上室，用不含血清的培养基将体积调至200μL，下室分别加入含0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL LF的完全培养基500μL，每组3个复孔，孵育24h后弃去小室液体，用棉签擦去上室未迁移细胞，4％多聚甲醛固定10min，1％结晶紫染色15min，PBS溶液冲洗，200倍视野下随机选取5处，读取细胞个数并计算均值。 结果: 1.MTT法结果显示三组细胞生长曲线均呈“S”形。 2.经过24 h培养，各组细胞均向空白划痕处迁移，但0μg/mL LF组迁移速度较慢。 3.Transwell法结果显示，24h后10μg/mL、20μg/mLLF组的迁移细胞数量均高于0μg/mL LF组，差异具有显著性(P＜0.05）。 第三章:乳铁蛋白对人牙周膜细胞成骨分化的影响 目的: 通过茜素红染色、PNPP法、qRT-PCR以及Western Blotting analysis观察乳铁蛋白对hPDLCs矿化结节形成以及对成骨诱导相关基因和蛋白表达的影响，探讨乳铁蛋白是否具有促进hPDLCs成骨分化的作用。 方法: 1.人牙周膜细胞的培养同第一章。 2.将第3代hPDLCs按5×104mL-1的密度接种于6孔板，待细胞单层贴壁后更换完全培养基为含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳铁蛋白的成骨诱导液，每组3个复孔，每3d换液1次，矿化14d后弃去培养液，4％多聚甲醛固定10min，1％茜素红染色30分钟，拍照并计算矿化结节面积。 3.取第3代生长良好的hPDLCs，按照5×104mL-1接种于6孔板中，待细胞单层贴壁后更换为含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳铁蛋白的成骨诱导培养基培养14d后使用细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，使用96孔板按照PNPP试剂盒说明书进行操作，检测碱性磷酸酶活性。 4.取第3代生长良好的hPDLCs，以5×104mL-1接种于6孔板中，完全培养基培养24h至贴壁，分为0μg/mL乳铁蛋白组、10μg/mL乳铁蛋白组、20μg/mL乳铁蛋白组加入不同浓度乳铁蛋白，并将培养基换为矿化诱导培养基。 5.取第3代生长良好的hPDLCs，以5×104mL-1接种于6孔板中，完全培养基培养24 h至贴壁，分别加入0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳铁蛋白以及矿化诱导培养基，14d后收集各组细胞，提取各组细胞的总蛋白。 结果: 1.茜素红染色结果显示各组均有矿化结节形成，但0μg/mLLF组矿化结节面积明显较另两组少，差异具有显著性。且20μg/mLLF组矿化结节面积较10μg/mLLF组大，差异具有显著性。 2.PNPP法检测碱性磷酸酶活性结果显示10μg/mLLF组与20μg/mLLF组碱性磷酸酶活性均高于0μg/mL LF组，且差异具有显著性。 3.成骨相关基因的表达。 4.Western Blot结果显示:10μg/mL LF组与20μg/mLLF组OCN、OPN的蛋白条带灰度值明显高于0μg/mL LF组，将各组灰度值进行统计学分析。 第四章:乳铁蛋白对LPS刺激下人牙周膜细胞成骨分化的影响 目的: 检测在LPS刺激下hPDLCs炎症因子分泌情况以及在炎症环境下LF对hPDLCs成骨分化的影响，从而探讨LF在炎症环境下对hPDLCs是否具有促进成骨的作用。 方法: 1.人牙周膜细胞的培养同第一章。 2.取第3代生长良好的hPDLCs，以5×104mL-1接种于6孔板中，当细胞生长至80％～90％时，将细胞分为空白对照组，0.01μg/mLLPS组，0.1μg/mLLPS组，1μg/mLLPS组。 3.取第3代处于对数生长期的hPDLCs，以5×104mL-1接种于6孔板中，当细胞生长至80％～90％融合时，更换为矿化诱导培养基，按照之前实验选择合适的LPS及LF刺激浓度，将细胞分为矿化液组，LPS+矿化液组，LPS+LF+矿化液组。 4.选取第3代生长良好并处于对数生长期的hPDLCs，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞，以5×104mL-1的密度接种于6孔板，放入恒温培养箱培养，待细胞单层贴壁后将细胞更换为矿化诱导培养基，分组同上。 5.选取第3代生长良好并处于对数生长期的hPDLCs，用0.25％胰蛋白酶消化，重悬细胞，以5×104mL-1的密度接种于6孔板，放入恒温培养箱培养，待细胞单层贴壁后将细胞更换为矿化诱导培养基，分组同上。 结果: 1.0.01μg/mL LPS组TLR4表达量与对照组无差异。 2.三组细胞均可观察到矿化结节的形成，其中LPS+LF+矿化液组矿化结节面积较大，与LPS组相比差异具有显著性，LPS+矿化液组矿化结节面积较矿化液组少，与矿化液组间差异具有显著性;但矿化液组与 LPS+LF+矿化液组之间的差异没有显著性。 3.LPS+矿化液组ALP活性表达量最低，LPS+LF+矿化液组ALP活性表达量最高，且与LPS组相比差异具有显著性。 4.Western Blot结果显示，LPS+矿化液组OCN、OPN的蛋白表达量较OM组略有下降，但差异不具有统计学意义。 结论: 1.通过组织块酶消化法分离培养的细胞在游出时间、成活率、感染率等方面均具有优势，细胞在传至第7代时仍具有增殖、矿化等能力;利用流式细胞仪分析细胞表面分子表型、免疫组化染色，并结合获取组织部位证明了所培养的细胞为hPDLCs，来源可靠，并且具有增殖、分化的能力。 2.在LF的作用下，hPDLCs增殖能力较不添加LF时提高较为明显，LF对水平迁移和垂直迁移能力均有增强作用，但hPDLCs的增殖和迁移并未表现出随浓度的增加而提高的趋势。 3.在矿化诱导正常状态hPDLCs过程中，LF可以促进矿化结节的形成，提高成骨相关基因以及成骨相关蛋白的表达，表明LF具有促进hPDLCs成骨分化的作用。其中成骨相关蛋白的表达量随着LF浓度的改变而产生差异，说明LF的浓度对hPDLCs成骨分化有一定影响。 4.LPS刺激后的hPDLCs炎症因子分泌增加，更加符合牙周炎发生发展过程中hPDLCs所处环境，在LPS刺激下发现通过LF的调节，hPDLCs成骨分化能力较仅有LPS刺激时有所提高。进一步为LF作为临床治疗牙周炎药物提供理论基础。
牙周病;乳铁蛋白;人牙周膜细胞;细胞增殖;细胞迁移;细胞分化;组织修复
南方医科大学
硕士
口腔临床医学
高杰
2016
中文
R781.4;R781.05
81
2017-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）