下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞增殖转移的抑制作用及机制研究
本文主要从以下几部分展开论述： 第一部分:下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用 目的: 本研究拟探索RbAp48在人宫颈癌的表达情况，进一步研究下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞增殖的影响。 方法: 1.组织芯片法检测224例人宫颈癌及癌旁组织中RbAp48的表达;2.以siRNA干扰技术下调RbAp48的表达;3.Western blot法检测siRbAp48下调人宫颈癌细胞RbAp48的表达水平;4.MTT、平板克隆实验检测下调RbAp48后对人宫颈癌细胞株Hela、MS751、SiHa增殖的的影响;5.β-半乳糖苷酶染色检测siRbAp48对Hela、MS751、SiHa细胞衰老的诱导作用;6.流式细胞术检测siRbAp48对细胞周期和凋亡的作用;7.以荷瘤小鼠模型观察下调RbAp48表达对宫颈癌细胞体内增殖的影响。 结果: 1.RbAp48在人宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，宫颈癌组织中呈强阳性者占67.86％（152例），而癌旁组织呈强阳性者为19.15％（9例）（**P＜0.01）。2.siRbAp48可有效下调Hela、MS751、SiHa细胞中RbAp48的表达。3.Hela细胞在20nM siRbAp48作用下产生抑制细胞增殖的效果，50nM作用达峰值;效果最明显为转染后第4天，其生存率降至36.11±4.47％。4.MS751细胞在10nMsiRbAp48作用下产生抑制细胞增殖的效果，50nM作用达峰值，效果最明显为转染后第7天，其生存率降至47.80±5.08％。5.SiHa细胞在30nMsiRbAp48作用下产生抑制细胞增殖的效果，50nM作用达峰值;效果最明显为转染后第5天，其生存率为79.35±8.50％。6.细胞克隆实验结果显示:Hela细胞siRNA NC对照组和siRbAp48组克隆形成数分别是87.17±8.63和36.67±2.89;MS751细胞siRNA NC对照组和siRbAp48组克隆形成数分别是130±8.89和87.33±1.16;SiHa细胞siRNA NC对照组和siRbAp48组克隆形成数分别是36.67±2.31和31.67±2.09。7.Hela细胞在siRbAp48作用48小时后，G2/M期细胞比例上升为32.33±7.14％（**P＜0.01），显示细胞发生了G2/M期阻滞; MS751细胞在siRbAp48作用96小时后G2/M期细胞比例上升为35.61±3.79％，显示同样发生了明显的G2/M期阻滞。8.下调RbAp48后Hela、MS751细胞胞内颗粒增多，β-半乳糖苷酶染色出现蓝染，呈明显的衰老表征。9.Hela细胞在siRbAp48作用72小时出现明显凋亡现象，其凋亡率为54.65±9.06％(**P＜0.01); MS751细胞在siRbAp48作用120小时出现明显的凋亡现象，其凋亡率为32.20±4.47％（*P＜0.05）。 结论: 1.RbAp48在人宫颈癌细胞中的表达显著高于癌旁正常组织细胞。2.siRbAp48能有效下调人宫颈癌细胞中RbAp48的表达。3.下调RbAp48表达可至Hela、MS751细胞发生G2/M期阻滞，诱导细胞发生衰老和凋亡，抑制细胞的增殖。4.下调RbAp48能增加人宫颈癌细胞对顺铂的敏感性。 第二部分:下调RbAp48表达抑制人宫颈癌细胞增殖的机制研究 目的: 探明下调RbAp48表达抑制人宫颈癌细胞增殖的作用机制。 方法: 1.Western blot法检测下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞Cyclin蛋白表达的影响;2.应用RNA干扰技术验证Cyclin蛋白家族在下调RbAp48抑制宫颈癌细胞生长中的作用;3.Western blot法检测Cyclin作用下游蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Rb、E2F1等的表达;4.以联合共转染的方法观察相关蛋白在siRbAp48抑制宫颈癌细胞生长中的作用;5.MTT法检测细胞体外增殖能力。 结果: 1.siRbAp48下调RbAp48表达后，Hela、MS751细胞的CyclinD1、CyclinE1及CyclinH的表达均明显下调;相应的CDK2、CDK4、CDK6蛋白也明显下调。2.下调RbAp48表达后Hela、MS751细胞的磷酸化Rb(P-Rb)和E2F1明显降低。3.与Hela、MS751细胞不同，SiHa细胞在下调RbAp48表达后，尽管Cyclin E1、CDK2、CDK4、CDK6、P-Rb、E2F1表达也均发生下调，但CyclinD1、Cyclin H的表达并未发生明显的变化。4.以siRb下调Rb表达后显著拮抗siRbAp48对细胞增殖的抑制作用;在Hela细胞，生存率由34.94±2.71％提高到56.12±2.72％（**P＜0.01）;在MS751细胞，生存率由44.24±5.83％提高到86.04±9.28％（**P＜0.01）;在SiHa细胞，生存率由80.03±7.65％提高到92.36±4.89％（**P＜0.01）。5.应用siCyclin D1、siCyclin E1和siCyclin H能有效下调宫颈癌细胞中Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin H的表达;下调Cyclin D1和Cyclin H的表达后，能显著抑制宫颈癌细胞的增殖，但下调Cyclin E1表达后抑制宫颈癌细胞增殖的效果则相对较弱。在Hela细胞中，siCyclin D1、siCyclin H和siCyclin E1组的生存率分别为39.19±7.77％、40.10±4.02％和82.83±5.94％;在MS751细胞中，siCyclinD1、 siCyclinH和siCyclinE1组的生存率分别为51.55±11.70％、49.61±7.51％和88.88±12.80％;在SiHa细胞中，siCyclin D1、 siCyclin H和siCyclinE1组的生存率分别为64.34±4.45％、80.74±11.57％和88.25±8.43％。6.以siRb下调Rb表达后能拮抗siCyclin D1对细胞增殖的抑制作用。在Hela细胞，生存率由34.00±3.43％提高到46.54±2.96％（**P＜0.01）;在MS751细胞，生存率由50.41±4.17％提高到60.05±5.05％（**P＜0.01）;在SiHa细胞，生存率由66.05±6.56％提高到98.33±5.61％（**P＜0.01）。7.下调Rb表达后可拮抗siCyclin H对细胞增殖的抑制作用。在Hela细胞，生存率由43.68±4.13％提高到77.54±5.47％（**P＜0.01）;在MS751细胞，生存率由56.29±5.00％提高到86.84±6.95％（**P＜0.01）;在SiHa细胞，生存率由85.78±2.47％提高到97.54±3.57％（*半P＜0.01）。 结论: 1.下调RbAp48表达显著抑制宫颈癌细胞中CyclinD1、CyclinE、CyclinH的表达。2.下调CyclinD1或CyclinH后可产生与下调RbAp48相同的抑制细胞增殖的效果。3.siRb可拮抗siRbAp48、siCyclin D1及Cyclin H抑制人宫颈癌细胞增殖的作用。4.下调CyclinD1、Cyclin H表达，诱导细胞周期阻滞是siRbAp48抑制人宫颈癌细胞增殖的一个重要机制。5.下调Rb表达可降低siRbAp48抑制宫颈癌增殖的效果，表明siRbAP48对肿瘤的抑制作用部分是通过调节Rb-E2F通路实现的。 第三部分:下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞株MS751迁移侵袭的抑制及其机制研究 目的: 探讨了下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞迁移侵袭的影响及其作用机制。 方法: 以划痕实验、Transwell小室检测下调RbAp48表达后对人宫颈癌细胞株MS751迁移侵袭的影响，以Western bolt检测Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、Snail、Twist、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达。 结果: 1.划痕实验和Transwell小室实验结果显示下调RbAp48表达后MS751细胞的迁移和侵袭数均明显减少。2.siRbAp48作用后MS751的间质细胞表型蛋白Vimentin、N-cadherin、MMP-2表达明显受到抑制;而上皮细胞表型蛋白E-cadherin、 TIMP-2表达明显升高，表明MS751细胞的上皮-间充质样变受到了抑制。3.进一步研究发现EMT上游调节蛋白Snail、Twist表达水平也发生了显著下调。 结论: 下调RbAp48表达能有效抑制宫颈癌MS751细胞株的上皮-间充质样变，从而降低了细胞的迁移和侵袭能力;其作用机制与降低Snail、Twist的表达有关。
宫颈癌;Rb相关蛋白48;基因表达;细胞迁移;细胞侵袭;抑制作用
南方医科大学
硕士
药理学
饶进军
2016
中文
R737.33;R730.3
94
2017-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）