致癌基因FOXK1通过诱导EMT促进结直肠癌细胞的侵袭转移
本文主要从以下几部分展开论述: 第一章:FOXK1在结肠癌中的表达与临床相关性的研究 目的: 本课题以组织芯片、免疫组化、Western、qRT-PCR、稳定表达株构建技术、双荧光素酶基因报告检测系统、生存分析等实验手段。对FOXK1的人体肿瘤组织(包括结直肠癌)中表达情况进行具体检测,进一步证实FOXK1在结直肠癌中癌基因的作用。围绕FOXK1在结肠肿瘤中的表达强弱及其与临床特点、生存率的关系进行探讨,继而为结肠癌的基因治疗提供帮助。 方法: 1、FOXK1在15类正常及肿瘤组织中的表达情况 2、FOXK1在结直肠癌组织及细胞中的表达情况 3、过表达FOXK1对结直肠癌细胞内癌基因表达的影响 4、FOXK1在结直肠癌组织中的表达与临床特点及预后的关系 5、数据的统计学处理 双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR结果用三或两次实验结果先进行方差齐性检验,方差齐(P>0.05)则进行两个处理组间独立样本t检验或多个处理组间one way ANOVA统计分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用LSD法;方差不齐(P<0.05)则应用Satterthwaite近似t检验或Welch检验分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用Duunett's T3检验。通过免疫组织化学的得分判断FOXK1的表达高低与临床病理(多个处理组)特点运用两样本率比较采用四格表资料的x2检验,多样本率的比较采用行列表资料的x2检验,如果某一个分组的样本特别小,相关性分析则采用Fisher's精确检验,生存分析方法采用log-rank检验。 结果: 1、FOXK1在多数正常组织中不表达,在肿瘤组织中均表达增高 2、FOXK1在结直肠癌组织及细胞中均呈高表达 2.1、FOXK1在原发性结直肠癌组织中表达增高 2.2、FOXK1在7个结直肠癌细胞系中均有表达 3、过表达FOXK1促进肠癌细胞内癌基因的启动子活性及mRNA水平的表达 3.1、Western blotting及qRT-PCR证实成功构建了pcDNA3.1-FOXK1-SW480及pcDNA3.1-SW480的稳定表达细胞株。 3.2、过表达FOXK1增加结直肠癌细胞内癌基因mRNA水平的表达 3.3、过表达FOXK1后提高结直肠癌细胞内Survivin,Cyclin D1和AP-1的转录活性 4、FOXK1的表达与结直肠癌患者7年总体生存率呈负相关 结论: 1.FOXK1在人体皮肤、睾丸、肾脏、卵巢、前列腺、肺、食管、胰腺、宫颈、大脑、胃、小肠、乳腺、结肠、直肠组织中扮演癌基因的角色; 2.过表达FOXK1促进结直肠癌细胞的致癌性; 3.FOXK1高表达与结直肠癌患者AJCC分期、TNM分期、肿瘤大小、病理分化程度、是否淋巴结累及相关; 4.FOXK1高表达是肠癌患者预后不良的因素之一 第二章:FOXK1在肠癌细胞侵袭、转移过程中EMT相关功能的研究 目的: 本课题将围绕FOXK1在结肠癌细胞侵袭、转移过程中EMT相关机制展开研究。 方法: 1、评估FOXK1在结直肠原位癌及转移癌的关系 2、低表达FOXK1对结肠癌细胞迁移、侵袭的影响 3、评估FOXK1表达的变化对结直肠癌细胞EMT的影响 4、阐明FOXK1是否可逆转rTGF-β1引起的EMT影响: 4.1、评价rTGF-β1对FOXK1、EMT相关蛋白表达的影响 4.2、低表达FOXK1阻断rTGF-β1对EMT的作用 5、压低FOXK1表达对体内肿瘤侵袭转移作用的影响 5.1、构建低表达FOXK1的稳定表达株 5.2、脾被膜下肝转移模型的建立 结果: 1、FOXK1在原发结直肠癌及淋巴结转移癌中均高表达 免疫组化结果证实,FOXK1在肿瘤细胞核及肿瘤相关的基质细胞中均呈高表达,即高表达FOXK1的肠癌细胞可以突破基底膜,具有更强的侵袭能力。正常结肠腺体上皮细胞未发现阳性表达。 2、低表达FOXK1抑制结直肠癌细胞迁移、侵袭能力 2.1、低表达FOXK1序列的验证 将FOXK1-siRNA及Scr-siRNA序列瞬时转染结肠癌细胞后,Westernblotting证实转染FOXK1-siRNA的结直肠癌细胞SW480和SW1116均较对照组FOXK1的表达明显压低。 2.2、低表达FOXK1抑制结肠癌细胞迁移能力 FOXK1-siRNA-SW480组肠癌细胞在划痕实验进行至60小时的迁移比率为52.02±0.087%,对照组SW480细胞已完全汇合。 2.3、低表达FOXK1抑制结肠癌细胞侵袭能力 压低组FOXK1-siRNA-SW480与对照组Scr-siRNA-SW480相比,Transwell实验计数穿过基底膜的细胞数分别为48.5±4.93和72.5±6.14,压低组FOXK1-siRNA-SW1116与对照组Scr-siRNA-SW1116相比,细胞数分别为61.25±6.65和118.5±15.76,差异具有统计学意义。 3、FOXK1表达水平与肠癌细胞EMT相关 3.1、过表达FOXK1对结肠癌细胞形态的影响 稳定表达株FOXK1-pcDNA3.1-SW480呈现出细长如成纤维细胞的形态,而对照细胞pcDNA3.1-SW480稳定表达株呈现出短圆、平坦的细胞形态。罗丹明结果显示:过表达FOXK1的稳定细胞边缘地带突出,伸出伪足。 3.2、FOXK1表达变化对EMT标记物的影响 应用间接免疫荧光方法对E-cadherin和Vimentin分别染色,荧光显微镜下观察其细胞分布。绿色荧光偶联Vimentin蛋白,红色荧光偶联E-cadherin,可以看出低表达FOXK1后,E-cadherin表达增加,且膜表达递增,Vimentin表达降低,有胞膜胞浆高表达降低为胞膜胞浆低表达;稳定表达株FOXK1-pcDNA3.1-SW480、 pcDNA3.1-SW480,瞬时转染的FOXK1-siRNA-SW480、Scr-siRNA-SW480四组细胞进行Western-blotting发现E-cadherin和γ-catenin的表达随FOXK1升高而降低,随FOXK1的表达降低而升高。 4、压低FOXK1可逆转rTGF-β1引起的EMT影响 4.1、rTGF-β1以时间依赖的方式诱导FOXK1和EMT相关蛋白的表达 rTGF-β1作用后0H、24H、48H观察,SW480和SW1116细胞中FOXK1表达量随作用时间的增加而递增,同时EMT相关蛋白的间质标识蛋白vimentin的表达亦出现递增,E-cadherin则随着rTGF-β1作用时间的增加而表达降低。 4.2、低表达FOXK1阻断rTGF-β1对FOXK1及EMT的诱导作用 对照组的SW1116细胞和SW480细胞在加入rTGF-β1后细胞变得细长,并伸出触角、伪足,而E-cadherin表达降低、Vimentin表达增加;Transwell试验中穿过基底膜的细胞也增加;但是通过转染FOXK1-siRNA后,纤长有触角、伪足的肠癌细胞再次变得短圆,而E-cadherin表达升高,vimentin的表达降低,侵袭试验中穿过基底膜的细胞数亦大大减少。以上数据均表明低表达FOXK1阻断rTGF-β1对FOXK1及EMT的诱导作用。 5、压低FOXK1表达对体内肿瘤侵袭转移作用的影响 5.1、慢病毒FOXK1-shRNA转染SW480细胞后FOXK1表达降低 Western blotting显示转染慢病毒FOXK1-shRNA的SW480细胞相对于对照组,FOXK1表达量明显下降。绿色荧光显示:在96小时,荧光强度和范围达到95%以上。 5.2、FOXK1可诱导裸鼠体内肿瘤转移及EMT过程 SW480/pEGFP-FOXK1和 SW480/pEGFP-N1(Vector),或SW480/pEGFP-FOXK1 shRNA和SW480/pEGFP-src shRNA相比较,FOXK1高表达组的SW480引起的肿瘤更大。HE染色证实肝组织中存在转移的肠癌腺体细胞。免疫组织化学明确正常肝细胞中E-cadherin的表达较FOXK1高表达细胞所引起的肝脏转移癌组织的更高,qRT-PCR验证得到SW480/pEGFP-N1(Vector)较SW480/pEGFP-FOXK1组E-cadherin表达高,说明低表达FOXK1可以抑制肠癌细胞的转移能力,高表达FOXK1可以促进长癌细胞的转移能力,并且高表达FOXK1可促进转移癌中的EMT过程。 结论: 1、FOXK1在原发结直肠癌及淋巴结转移癌中均呈现高表达 2、低表达FOXK1抑制结直肠癌细胞EMT、迁移、侵袭 3、低表达FOXK1可逆转rTGF-β1诱导的结直肠癌细胞EMT、侵袭作用 4、动物实验证实低表达FOXK1可抑制结直肠癌细胞转移、EMT。
结直肠癌;FOXK1基因;基因表达;Wnt信号通路
南方医科大学
博士
内科学(消化内科学)
王继德;刘思德;白杨
2016
中文
R735.34;R730.2
126
2017-02-28(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)