STAT3在斑马鱼侧线毛细胞顺铂损伤中的表达及意义
已知鱼类内耳突变基因中约1/3与人类综合征性和非综合征性耳聋有关。斑马鱼(zebrafish)作为一种重要的脊椎动物模式生物，虽然没有外耳和中耳，但具有脊椎动物典型的内耳结构，其内耳毛细胞组织形态和分子构成均与哺乳动物内耳毛细胞极为相似[1]。 顺铂为第一代临床化疗铂类药物之一，在治疗鼻咽癌等头颈部恶性肿瘤中发挥着重要作用[2]。然而顺铂在治疗肿瘤的同时，也会对机体产生不同程度的毒副作用。据报道接受顺铂化疗的恶性肿瘤患者中，约93％出现渐进性或不可逆性感音神经性聋，严重影响患者生活质量。 STAT3是信号转导与转录激活因子家族家族(STATs)中重要的一员，它是一种脱氧核糖核酸结合蛋白，具有信号转导和转录调控功能，是JAK-STAT信号通路的重要环节[5]。正常组织细胞中，STAT3主要参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程。生长因子、细胞因子等多肽类配体在细胞表面与相应的受体结合，受体在胞浆内与受体型酪氨酸蛋白激酶JAKs相结合，受体上的酪氨酸残基磷酸化并使使JAKs活化;活化的JAKs和受体募集细胞浆内的STAT3，并激活STAT3。 目的: 建立幼年斑马鱼侧线毛细胞顺铂损伤模型;研究STAT3在幼年斑马鱼侧线毛细胞顺铂损伤中的作用。 方法: 1.顺铂损伤幼年斑马鱼侧线毛细胞及损伤后毛细胞数量和凋亡信号检测 1.1 顺铂处理受精后第5天(5dpf) AB品系斑马鱼 用系统水将顺铂粉末溶解至3333uM，-20℃储存。取受精后第5天(5dpf)AB品系幼年斑马鱼，随机分为系统水对照组、不同浓度(125uM、250uM、500uM、750uM、1000uM)顺铂处理组，分别作用1h，2h，3h，4h，6h。每组7条鱼。重复3次。 1.2 幼年斑马鱼侧线毛细胞染色 系统水对照组及顺铂处理组分别处理1h，2h，3h，4h，6h后，弃掉处理液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。然后置于2uM荧光活性染液Yo-Pro-1中避光染色1h，弃掉Yo-Pro-1荧光活性染液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。用0.02％ MESS麻醉后，置于凹面载玻片上，用注射器针头调整斑马鱼体位，荧光显微镜下观察、拍照，选择SO1、SO2、O1、OC1四个固定神经丘进行毛细胞计数。 1.3 幼年斑马鱼侧线毛细胞凋亡检测 取受精后第5天(5dpf)AB品系幼年斑马鱼，随机分为系统水对照组、250uM顺铂处理组，分别处理3h。弃掉处理液，用PBS清洗，每次5min，共3次。然后于TUNEL染液中避光染色1h，弃掉TUNEL染色液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。将斑马鱼置于凹面载玻片上，用注射器针头调整斑马鱼体位，荧光显微镜下观察、拍照，计数毛细胞凋亡信号。每组10条。重复3次。 2.中性粒细胞可能参与了顺铂对斑马鱼侧线毛细胞的损伤过程 取5dpf转基因斑马鱼Tg(lyz∶DsRed)，随机分为对照组和实验组。实验组用250uM顺铂处理3h，对照组加入等量系统水。处理完毕，用系统水清洗。置于2uM YO-Pro-1中避光染色1h，系统水漂洗3次，每次5min。在荧光显微镜下观察。每组10条鱼，重复3次。 3.STAT3在幼年斑马鱼侧线毛细胞顺铂损伤中激活 3.1 RT-q PCR方法检测幼年斑马鱼STAT表达（详细步骤见实验方法） 3.2 原位杂交方法检测幼年斑马鱼神经丘STAT3表达（详细步骤见实验方法）。 4.N-乙酰半胱氨酸(NAC)减弱顺铂对幼年斑马鱼侧线毛细胞的损伤 4.1 N-乙酰半胱氨酸和顺铂联合处理5dpfAB品系斑马鱼 取5dpf幼年斑马鱼，随机分为对照组、顺铂处理组和NAC+顺铂处理组，NAC+顺铂处理组先用不同浓度N-乙酰半胱氨酸(NAC)(10uM、50uM、100uM、200uM)处理2h，然后加入250uM顺铂溶液处理3h，顺铂处理组只用250uM顺铂溶液处理3h，对照组加入等量系统水。 4.2 斑马鱼侧线毛细胞染色 对照组及实验组分别处理3h后，弃掉处理液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。然后于2uM荧光活性染液Yo-Pro-1中避光染色1h，弃掉Yo-Pro-1荧光活性染液，用PBS液清洗，每次5min，共3次。用0.02％ MESS麻醉后，置于凹面载玻片上，调整斑马鱼体位充分暴露待观察神经丘，荧光显微镜下观察、拍照，选择SO1、SO2、O1、OC1四个固定神经丘进行毛细胞计数。 5.统计学分析 资料分析采用SPSS19.0统计分析软件，数据以均值±标准差（(x)±s）表示，两因素多水平比较采用重复测量的方差分析，两组比较采用独立样本t检验，单因素多水平比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐性检验采取Levene检验，方差齐者用LSD-t法，方差不齐者用Dunnett-t法。设P＜0.05差异有统计学意义。 结果: 1.顺铂损伤幼年斑马鱼侧线毛细胞 用顺铂处理后计数SO1、SO2、O1、OC1四个神经丘得出毛细胞均数。正常斑马鱼侧线这四个神经丘毛细胞均数为10.4167±0.92983;用250uM顺铂处理3h后，计数毛细胞均数为5.2381±0.81577;用250uM顺铂处理6h后，计数毛细胞均数为0.0357±0.08964;用1000uM顺铂处理3h后，计数毛细胞均数为0.5±0.45415;用1000uM顺铂处理6h后，计数毛细胞均数为0±0。经统计各顺铂处理组的侧线毛细胞数量均少于正常对照组，且以上处理组与对照组相比，毛细胞数量的差异均有统计学意义(P＜0.05)。从数据可看出，斑马鱼侧线毛细胞数量随顺铂浓度的增加逐渐减少，且顺铂作用时间越长，侧线毛细胞数量减少越明显。这说明顺铂对斑马鱼侧线毛细胞的损伤具有浓度和时间依赖性。 2.顺铂损伤后幼年斑马鱼侧线毛细胞的凋亡检测通过TUNEL染色观察斑马鱼侧线神经丘毛细胞凋亡信号，250uM顺铂处理3h后，侧线神经丘毛细胞凋亡信号数为:0.7333±0.14710。对照组神经丘毛细胞凋亡信号数为:0.0883±0.13786。顺铂处理组侧线毛细胞凋亡信号数大于对照组(P＜0.01)。说明顺铂导致侧线毛细胞损伤可通过细胞凋亡的方式实现。 3.中性粒细胞可能参与了顺铂对斑马鱼侧线毛细胞的损伤过程 中性粒细胞是由骨髓造血干细胞分化发育并进入血液、组织中，正常情况下，血液中的中性粒细胞一般附着于血管壁上，另一半随血液循环。在机体需要时骨髓中储备的大量成熟中性粒细胞会立即进入血循环。在用顺铂处理斑马鱼的过程中，神经丘附近有中性粒细胞聚集现象，并且在显微镜下观察数分钟，我们观察到了中性粒细胞向神经丘移动的现象;而对照组斑马鱼没有此现象。 由此可推断，中性粒细胞可能参与了顺铂对斑马鱼侧线毛细胞的损伤过程，但是中性粒细胞在此过程中起到的具体作用有待进一步观察。 4.STAT3在顺铂导致的斑马鱼侧线毛细胞损伤中表达上调 原位杂交结果显示:实验组侧线神经丘STAT3信号高于对照组，且顺铂处理3h时信号高于顺铂处理6h时，提示顺铂处理3h时STAT3表达最高。荧光实时定量PCR结果与原位杂交结果相符合。STAT3抑制剂S3I-201+顺铂处理组与顺铂处理组的侧线毛细胞数分别为:3.6364±0.71906，2.25±0.55572，两组差异有统计学意义(P＜0.05)。然而与系统水对照组的9.3462±0.99759相比，仍明显减少(P＜0.01)。 5.N-乙酰半胱氨酸(NAC)可减弱顺铂对幼年斑马鱼侧线毛细胞的损伤 NAC+顺铂联合处理组斑马鱼侧线毛细胞数分别为:4.4±0.5525，5.4531±0.8814，6.0625±1.1893，7.4706±0.4039。顺铂处理组斑马鱼侧线毛细胞数为:3.5833±0.9885。对照组斑马鱼侧线毛细胞数为:9.25±0.9843。统计显示NAC预处理后再用顺铂处理的斑马鱼侧线毛细胞数量明显高于只用顺铂处理的斑马鱼侧线毛细胞数(P＜0.01)，且随着N-乙酰半胱氨酸浓度的增加，保护作用越强，推测ROS在顺铂造成的侧线毛细胞损伤中起着重要作用。 结论: 1.用浸泡斑马鱼的方法建立斑马鱼侧线毛细胞顺铂损伤模型可行，且顺铂对斑马鱼侧线毛细胞的损伤存在时间和浓度依赖性;顺铂导致斑马鱼侧线神经丘毛细胞的死亡可通过细胞凋亡的方式实现。 2.中性粒细胞可能参与了顺铂对斑马鱼侧线毛细胞的损伤过程，需进一步观察中性粒细胞参与该损伤过程的方式，探讨中性粒细胞捕获机制(NETs)是否参与该过程。 3.STAT3在顺铂导致的斑马鱼侧线毛细胞损伤中表达上调;抑制STAT3后，可减弱顺铂对侧线毛细胞的损伤。说明STAT3在顺铂损伤侧线毛细胞的过程中起了促进作用。 4.ROS系统抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对顺铂导致的斑马鱼侧线毛细胞损伤有一定的保护作用，可能为后期临床应用提供实验基础。
感音神经性聋;毛细胞顺铂损伤;侧线系统;脱氧核糖核酸结合蛋白3;蛋白表达
南方医科大学
硕士
耳鼻咽喉科学
龙孝斌;张文清
2016
中文
R764.431
75
2017-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）