鼻咽癌组织差异miRNA表达谱筛选和调控网络分析
目的: 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)作为一种起源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，多见于我国南方及东南亚地区，尤其高发于广东省，素有“广东瘤”之称。由于鼻咽癌具有发病隐匿、转移早、个体差异大的特点，尽管目前以调强放射治疗为主的综合治疗可以使鼻咽局部有较好的控制，但鼻咽癌的五年生存率始终徘徊在70％左右，因而针对性的肿瘤个体化治疗成为大势所趋。然而，个体化治疗需建立在精确的分子标志物表达谱分析和差异基因的功能研究的理论基础上。因此筛选出与鼻咽癌的局部侵犯、远处转移、血管生成等肿瘤生物学行为密切相关的表达谱，通过对其中重要分子标志物的功能和调控通路研究，能进一步明确鼻咽癌发生发展的分子机制，有助于制定出鼻咽癌的个体化治疗方案，这对于提高鼻咽癌患者生存率，生存质量、降低治疗成本具有极其重要的临床意义。 在鼻咽癌中，目前研究发现多个miRNA参与了鼻咽癌的发病机制，其表达失调可影响鼻咽癌细胞的增殖、凋亡、运动、侵袭和转移能力，并与鼻咽癌病人的预后密切相关。miR-26在鼻咽癌细胞系及鼻咽癌组织标本中表达下调，靶向EZH2参与抑制鼻咽癌细胞的增殖及侵袭作用。同样的，miR-9在鼻咽癌表达下调，并通过靶向CXCR4调控鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。截至2016年，已有超过30个microRNA参与鼻咽癌疾病发生及发展。然而，根据检索文献和本课题组目前关于鼻咽癌组织中的miRNA的功能及机制研究，发现在已有的研究中，缺乏对以组织差异miRNA表达谱为中心的全方位多层次调控网络分析，因而本研究将结合高通量测序技术与生物信息学分析对鼻咽癌组织中miRNA表达谱及以miRNA为中心的调控网络进行全面而系统的分析。 为了让筛选出的差异miRNA表达谱具有更好的代表性和重复性，本研究利用激光显微切割技术(LCM，laser capture microdissection)，纯化鼻咽癌组织标本中的肿瘤细胞。并进一步通过新一代测序技术又称高通量测序技术，筛选得到更加精准的差异miRNA表达谱。再将所得的鼻咽癌组织差异miRNA表达谱为基础，结合生物信息学方法分析miRNA调控网络。在本研究中，除了常规的GO(Gene Ontology)功能注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路注释分析方法，进一步增加了信号通路分析(IPA，Ingenuity pathway analysis)。其中GO和KEGG分析着重于分析靶基因的功能分布，IPA则在网络构建方面具有不可取代的优势。在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤中均有研究表明利用IPA构建的miRNA调控网络可以在揭示肿瘤分子机制、指导治疗及评估预后方面发挥重要作用。然而目前在鼻咽癌组织的差异miRNA表达谱研究中，尚无利用IPA构建miRNA调控网络的先例。关于miRNA在鼻咽癌中通过何种调控网络调节肿瘤的发生发展过程值得我们进行深入的探讨。 所以，本课题的目的在于筛选出鼻咽癌组织与正常组织间的差异miRNA表达谱，利用生物信息学分析预测靶基因的功能分布，并构建以miRNA为中心的调控网络，旨在从更加全面和深层的角度分析肿瘤的发病及发展机制，从而为进一步改善鼻咽癌患者的治疗、预后奠定理论基础。 方法: 1.临床资料 1.1 12例鼻咽癌组织和8例非癌鼻咽上皮组织用于LCM和高通量测序。所有组织均经病理学检查确诊，鼻咽癌患者在活检前均未接受放化疗等治疗。鼻咽癌组中病例的临床分期分布、年龄分布和性别比例与鼻咽癌临床特点相一致，并按照相近的年龄分布与性别比例筛选对照组病例。 1.2 201例鼻咽癌组织和25例非癌鼻咽上皮组织用于高通量测序结果的qPCR验证。病例的临床资料筛选标准同上，其中65例鼻咽癌组织和20例非癌鼻咽上皮组织用于初步验证，检测miRNA与临床分期及TNM分期间的相关性通过将样本量扩大至201例鼻咽癌组织和25例非癌鼻咽上皮组织。 2.组织标本的收集和冰冻切片的制作 组织标本在活检术后立即放入液氮中长期冻存。冰冻切片在-21℃-25℃之间进行，选取组织最大横切面，调整切片厚度为8um，每个样品连续缓慢切片18-20张后，在无水乙醇中固定10min。然后经过漂洗、苏木素染色、分化、伊红染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明等简易H&E染色步骤制作LCM所需切片。 3.激光显微切割(LCM) 装置好玻片及配套样品收集离心管，在10倍或20倍镜下圈出目的区域，如癌巢或者正常鼻咽上皮，于10倍镜下进行切割，利用收集离心管管盖将切割后的目的组织片进行粘附收集。切取完毕后在离心管内加入100ulRNAlater。然后放于-80℃低温冰箱中保存。 结果: 1.鼻咽癌组织中差异miRNA的筛选 结合LCM技术与高通量测序对12例鼻咽癌组织和8例鼻咽非癌对照组织进行差异miRNA检测，将clean date进行比对，基于NCBI GenBank、Rfam(10.1)和mirbase21.0数据库，可以匹配到827个已知人源miRNA。将这827个miRNA的TPM值导入GeneSpring软件中进行运算后，得到由8个已知miRNA构成的鼻咽癌组织差异miRNA表达谱，其中包含4个上调miRNA(miR-205-5p、miR-92a-3p、miR-193b-3p和miR-27a-5p)和4个下调miRNA(miR-34c-5p、miR-375、miR-92b-3p和miR-449c-5p)。它们在在NPC组和正常对照组间的表达差异倍数和相应的FDR值分别为miR-205-5p(fold change=3.9103，FDR＜0.01)，miR-92a-3p(fold change=4.5575, FDR＜0.01),miR-193b-3p(fold change=257.719,FDR=0.03), miR-27a-5p(fold change=353.84, FDR=0.017), miR-34c-5p(foldchange=-565.0915, FDR＜0.01),miR-375(fold change=-226.8843, FDR＜0.01),miR-92b-3p(fold change=-10.7984, FDR＜0.01),miR-449c-5p(fold change=-1968.9108，FDR＜0.01)。根据所得的TPM值绘制热图和散点图，分析发现筛选出的差异miRNA表达谱可以对NPC组与鼻咽非癌对照组进行区分。这说明了我们筛选出来差异miRNA具有较好的组内重复性，可以在同种组织类型中得到重复。 2.差异miRNA的qPCR验证与临床分期相关性分析 利用qPCR对高通量测序所得的差异miRNA表达谱进行验证。经过验证得到7个具有统计学意义的差异miRNA，分别为miR-205-5p(t=-5.209，P＜0.001)，miR-92a-3p(t=-4.457,P=0.001), miR-193b-3p(t=-3.64,P＜0.001), miR-27a-5p(t=-2.977,P=0.005), miR-34c-5p(t=3.776,P=0.001), miR-375(t=2.179,P=0.004), miR-92b-3p(t=-1.297，P=0.198)和miR-449c-5p(t=1.347，P=0.007)。跟对照组进行比较，其中miR-205-5p、miR-92a-3p、miR-193b-3p、miR-27a-5p均为高表达，miR-34c-5p、miR-375和miR-449c-5p均为低表达，与高通量测序结果相一致。 分析这7个miRNA与临床分期之间的相关性，发现仅有miR-34c-5p表现出与临床分期间明显的负相关调节，即随着临床分期的升高，其表达量逐步降低。 结论: 1.鼻咽癌组织与鼻咽非癌对照组织间的miRNA差异表达谱，包括4个上调miRNA(miR-205-5p、miR-92a-3p、miR-193b-3p、miR-27a-5p)和4个下调miRNA(miR-34c-5p、miR-375、miR-92b-3p和miR-449c-5p)。 2.鼻咽癌组织qPCR验证确认了miR-205-5p、miR-92a-3p、miR-193b-3p和miR-27a-5p表达上调，以及miR-34c-5p、miR-375、miR-449c-5p的表达下调。miR-34c-5p的表达量与鼻咽癌临床分期和T分期呈负相关。 3.GO分析提示预测的靶基因功能集中于与癌细胞密切相关的细胞修复、运动及分泌功能，KEGG通路分析则提示自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路可能是miR-34c和miR-449c在鼻咽癌调控肿瘤免疫中的作用途径。 4.IPA分析得到以miR-34c-5p为中心的调控网络，通过调节TP53、MET、CCND1、CDK6、Bcl2表达水平并由PI3K/AKT/mTOR通路作用于鼻咽癌细胞周期，影响癌细胞的生长、增殖、侵袭及转移，为制定分子靶向治疗、减少复发转移提供分子理论基础。
鼻咽癌;微小核糖核酸;基因表达谱;功能分布;调控网络
南方医科大学
博士
耳鼻喉头颈外科
李湘平
2016
中文
R739.63;R730.23
119
2017-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）