胰高血糖素样肽-2对全肠外营养小鼠肠黏膜屏障损伤的保护作用研究
全肠外营养(total parenteral nutrition，TPN)应用于临床治疗已有近半个世纪，它不但可以维护机体正常生理活动所需的营养物质与能量，而且还可改善营养状况和促进康复。目前，TPN已在临床广乏应用于肠衰竭病人的救治，特别是短肠综合征的营养支持。然而，长期的TPN支持会导致肠道黏膜萎缩、破坏，免疫功能障碍，从而增加肠道细菌易位和感染并发症等风险的发生，严重的甚至可导致肠源性败血症，但其机制仍未完全明确。如何有效地避免或减少TPN治疗所导致的这些并发症发生是当前外科营养治疗领域的重要问题。 胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)是一种肠道特异性的生长因子，它具有增加肠道营养物质的吸收，改善肠道血流的供应，促进肠黏膜损伤的修复与维持肠黏膜结构的完整性等作用，近年来越来越受到学者的关注。GLP-2与其他多肽类生长因子不同的是其发挥生理功能或药理作用强，且具有特异性（仅局限于胃肠道），在应用于治疗肠道屏障功能障碍的疾病中前景广阔。 替度鲁肽(Teduglutide)是一种人GLP-2的类似物，目前用在治疗短肠综合征和炎症性肠病进行了Ⅲ期临床试验，并已取得了良好的疗效。研究表明，外源性补充GLP-2类似物可以使短肠综合征病人减少对肠外营养的依赖和改善其生活质量。短肠综合征病人的肠内外营养支持治疗的最终目的之一是希望能够摆脱肠外营养，依靠肠内营养甚至口服进食来维持生存。但长期的TPN治疗可导致肠道黏膜屏障功能受损，甚至发生细菌易位和感染并发生症等风险，而治疗短肠综合征的新药—GLP-2类似物具有特异性地修复肠上皮细胞以及维持肠黏膜屏障的完整性等作用，因此，探讨GLP-2对TPN导致的肠黏膜屏障损伤具有十分重要的临床意义。 长期的TPN支持不仅可以导致肠黏膜机械屏障的损伤，而且还会引起肠黏膜免疫屏障的破坏。最近研究表明，GLP-2不但可保护肠黏膜机械屏障，而还可能在肠道黏膜免疫反应中起着重要的作用。在休克复苏大鼠模型中，GLP-2可以增加大鼠胆汁中的sIgA分泌水平;在给予GLP-2治疗重症急性胰腺炎的小鼠中发现，该组小鼠肠黏膜的CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞和IgAλ表达水平增加，这进一步说明了GLP-2对肠道黏膜免疫屏障有一定的保护作用。但目前国内外文献尚未发现有关GLP-2对TPN动物模型的肠黏膜免疫屏障影响的相关研究。 针对TPN导致的肠黏膜屏障损伤所带来一系列并发症这一常见的临床问题，并鉴于GLP-2对肠道黏膜上皮细胞有较确切的保护作用，我们设计动物实验来探讨GLP-2对TPN动物模型肠黏膜屏障的影响。我们首先通过颈外静脉置管建立TPN小鼠模型，观察GLP-2是否可以预防TPN导致的肠黏膜萎缩。更进一步的研究是，观察GLP-2是否可以保护TPN导致的肠黏膜机械屏障损伤以及其相关的保护机制。另一方面，我们也初步探讨GLP-2是否可改善TPN所致的肠粘膜免疫损伤。 第一章 GLP-2对全肠外营养小鼠肠道萎缩的预防作用 目的： 探讨GLP-2对全肠外营养(TPN)导致的肠道萎缩的影响。 方法： 选取6-8周健康ICR小鼠（n=24，33.6±1.1），随机平均分为3组:自由进食组（Chow组）、全肠外营养组（TPN组）和全肠外营养+注射GLP-2组(TPN+GLP-2组)。氯胺酮腹腔注射进行麻醉，颈外静脉置管2d后，TPN组给予全肠外营养液，TPN+GLP-2组除给予等量上述营养液外还经颈外静脉注射30ug/次GLP-2，一天2次（共60ug/d）。每天定时称量小鼠体重，于第7d处死小鼠，取出小肠并测量，留取回肠末端组织检测相关蛋白和mRNA的表达量，并观察肠黏膜的形态学改变。 结果： 与chow组比较，TPN组小鼠的体重下降明显，小肠长度明显缩短，小肠绒毛高度和微绒毛变矮以及隐窝深度变浅（均P＜0.05）。而GLP-2组小鼠的上述指标均有所改善（均P＜0.05）。GLP-2可增加TPN小鼠肠组织增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白与mRNA的表达，减少肠组织cleaved caspase-3蛋白的表达。 结论： GLP-2可以预防TPN小鼠肠黏膜萎缩，其机制可能是通过刺激肠上皮组织PCNA蛋白与mRNA的表达以及减少cleaved caspase-3蛋白表达有关。 第二章 GLP-2对全肠外营养小鼠肠道机械屏障的影响 目的： 探讨GLP-2对全肠外营养（TPN）小鼠肠道机械屏障的影响及相关机制。 方法： 将36只正常健康ICR小鼠随机平均分为3组:自由进食组(Chow组)、全肠外营养组（TPN组）和全肠外营养+注射GLP-2组（TPN+GLP-2组）。经颈外静脉置管2d后，TPN组给予全肠外营养液，TPN+GLP-2组除给予等量上述营养液外还注射30ug/次GLP-2，一天2次（共60ug/d）。在第7d处死小鼠，留取眼球静脉血，留取回肠末端组织检测相关蛋白和mRNA表达，使用透射电子显微镜观察肠黏膜组织的形态学改变。 结果： 与Chow组比较，TPN组小鼠血清IL-6和TNF-α水平显著升高，而IL-10下降（均P＜0.05），与TPN组比较，TPN+GLP-2组血清的IL-6和TNF-α水平降低，IL-10水平升高（均P＜0.05）。TPN、TPN+GLP-2组的IL-6、TNF-α和IL-10的mRNA表达也与其血清水平变化相一致（均P＜0.05）。与Chow比较，TPN组小鼠的血浆内毒素和D-乳酸水平升高（均P＜0.05），而TPN+GLP-2组的变化不明显（均P＞0.05）。与Chow组比较，TPN组小鼠的MPO含量与Caspase-3活性增加(P＞0.05)，而TPN+GLP-2组的变化不显著（均P＞0.05）。电镜观察结果显示，与Chow组比较，TPN组小鼠微绒毛稀少，排列不齐，出现倒伏、脱落，紧密连接蛋白遭到破坏，而TPN+GLP-2组的微绒毛稍整齐，紧密连接蛋白破坏不明显;免疫荧光结果表明，与Chow组比较，TPN组肠组织的紧密连接Occludin、Caudin-1和ZO-1蛋白荧光较少，不连续，而TPN+GLP-2组的变化不明显。Western blot结果显示，与Chow组比较，TPN组小鼠肠组织的紧密连接蛋白Occludin、Caudin-1表达减少（均P＜0.05），而TPN+GLP-2组的与Chow组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。TPN组小鼠肠组织PCNA、Bel-2蛋白表达减少（均P＜0.05），而Bax蛋白表达增加（均P＜0.05）;相反，TPN+GLP-2组的变化与Chow组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。 结论： 1.TPN支持5天后可导致小鼠肠黏膜机械屏障受损，表现为促炎症反应增强，血浆内毒素增加，紧密连接蛋白遭到破坏等。 2.GLP-2可改善TPN导致的肠黏膜机械屏障损伤，其体现在GLP-2可减轻肠组织的病理损伤及紧密连接蛋白损伤，降低肠黏膜通透性，降低炎症因子的表达等。 3.GLP-2保护TPN导致的肠黏膜机械屏障损伤机制可能是促进肠黏膜上皮细胞增殖、抑制其细胞凋亡以及减轻肠组织炎症反应，从而对肠黏膜机械屏障起保护作用。 第三章 GLP-2对全肠外营养小鼠肠道免疫屏障的影响 目的： 探讨GLP-2对全肠外营养(TPN)小鼠肠道黏膜免疫屏障的影响。 方法： 将30只6-8周的健康ICR小鼠随机平均分为3组:自由进食组（Chow组）、全肠外营养组（TPN组）和全肠外营养+注射GLP-2组（TPN+GLP-2组）。在颈外静脉置管2d后，TPN组给予全肠外营养液，TPN+GLP-2组除给予等量上述营养液外还注射30ug/次GLP-2，一天2次（共60ug/d）。第7d后处死小鼠，留取门静脉血检测细菌易位率，留取小肠肠腔冲洗液检测sIgA含量，取回肠末端组织检测IL-4、IL-13等相关蛋白和mRNA的表达，检测回肠末端组织sIgA水平，并做相关蛋白的免疫荧光染色检测，留取回肠末端组织作PAS染色观察小肠杯状细胞数目的变化。 结果： 与TPN组比较，TPN+GLP-2组小鼠的回肠组织杯状细胞数目明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。ELISA结果显示，与Chow组比较，TPN组小鼠的肠组织和冲洗液中的sIgA含量、肠组织IL-4和IL-13水平均减少（均P＜0.05）。而与TPN组比较，TPN+GLP-2组的肠组织和冲洗液中sIgA含量、肠组织IL-4和IL-13水平均有所增加（均P＜0.05）。与Chow组比较，TPN显著减少肠组织的sPLA2和cryptdin-4的水平（均P＜0.05），而与TPN组比较，注射GLP-2后可改善肠组织的sPLA2和cryptdin-4水平（均P＜0.05）。Western blot结果显示，与TPN组比较，TPN+GLP-2组的lysozyme与PIgR蛋白表达均增加（均P＜0.05）。qRT-PCR结果显示，与TPN组比较，TPN+GLP-2组小鼠的IL-4 mRNA、IL-13mRNA、Lysozyme mRNA、pIgR mRNA、SPLA2 mRNA、Mucin2 mRNA和Cryptdin4 mRNA表达均增加（均P＜0.05），但Tff3 mRNA与RegⅢ-γ mRNA的表达均无明显差异。另外，与TPN组比较，TPN+GLP-2组小鼠血清中精氨酸和瓜氨酸水平显著升高（均P＜0.05）。免疫荧光结果显示，与TPN组比较，TPN+GLP-2组的Lysozyme和PIgR蛋白荧光较多，且较连续。另外与TPN组比较，TPN+GLP-2组的门静脉血、肝与脾的总的细菌易位率明显降低（均P＜0.05）。 结论： 1.TPN可导致肠黏膜免疫屏障损伤，包括固有免疫与获得性免疫的损伤。 2.GLP-2可减少TPN导致的细菌易位率，可能与提高肠道黏膜免疫相关。 3.GLP-2可改善TPN导致的肠黏膜免疫损伤，主要体现在增加肠组织sIgA、lysozyme、sPLA2和cryptdin4的分泌，其相关机制可能与增加血中精氨酸、瓜氨酸及改善肠道组织中IL-4和IL-13有关。
肠道萎缩;肠黏膜;机械屏障;免疫屏障;全肠外营养;胰高血糖素样肽-2
南方医科大学
硕士
外科学（普外）
王新颖
2016
中文
R574.05
121
2017-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）