三碘甲状腺原氨酸减轻七氟醚神经毒性的机制研究
七氟醚是临床麻醉中常用的一种吸入性麻醉药，因起效迅速，可控性好，气道刺激性小等优点被广泛应用于小儿麻醉。最近的研究表明常用的吸入全麻药暴露对中枢神经系统均有不同程度的毒害作用，主要表现为学习记忆等认知功能的下降。处于发育期和退行性改变期的中枢神经系统对全麻药的毒性尤为敏感。处于发育期的儿童暴露于吸入麻醉药后，在其成长过程中会出现行为改变及精神症状，一项临床回顾性研究表明小于四岁的小儿暴露于麻醉和手术会增加他们发育中的阅读、写作和数学计算能力障碍的风险。动物实验研究也表明长时间高浓度吸入七氟醚损害发育中的脑细胞，还可能导致远期的神经认知功能障碍。在老年患者，术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)的发生率显著高于实施同类手术麻醉的青壮年患者，且研究表明，吸入麻醉药暴露可加重中枢神经退行性改变，致原有认知功能障碍加重。 最近的统计表明，美国每年约有数以百万计的患儿需要手术和麻醉，如何防治吸入性全麻药物如七氟醚对于发育期大脑的神经毒性作用，已经成为近年来众多临床医生和科学工作者共同探讨的话题之一。目前由于七氟醚等全麻药物的作用机理及其对发育期大脑的神经毒性未能完全阐明，大部分的研究都是集中在临床前的动物水平。加之临床研究的可行性难度较大，所以对于全麻药物中枢神经毒性防治的研究还处于探索的初步阶段。而且大多是来自体外的非生理性激素或药物，防治效果也并不确切。甲状腺激素(TH)是人和动物正常生长发育必需的一类激素，在大脑的发育、分化、功能的维持中起着重要作用，可激活mTOR等信号转导通路，影响基因转录与蛋白质翻译，调控神经元增殖、突触的发育成熟，改善学习记忆等认知功能。在新生时期，也是大脑发育的关键时期。麻醉剂及其代谢产物可能对甲状腺的功能状态产生影响，干扰甲状腺激素的分泌。本实验拟观察TH对七氟醚麻醉后新生大鼠成年后认知功能的影响及大脑海马的神经元显微结构、突触后密度蛋白-95(PSD-95)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚基2A与2B(NR2A/NR2B)表达的变化，从认知功能障碍相关机制的角度探讨七氟醚中枢神经系统毒性的发生及防治机制，为全麻药物神经毒性的防治提供新的思路。 目的: 通过旷场实验(OFT)、糖水偏好实验(SPT)、高架十字迷宫实验(EPMT)、水迷宫实验(WMT)等行为学实验，观察新生大鼠七氟醚麻醉及T3干预后成年期大鼠认知功能和情绪的改变;通过原位缺口末端标记法(TUNEL)观察大鼠海马区细胞凋亡情况;通过Nissl染色方法观察海马CA1及CA3区神经元的密度;应用溴脱氧嘧啶(BrdU)标记技术标记大鼠海马齿状回(DG)区新增殖细胞以观察神经元增殖情况;应用高尔基银染色技术观察大鼠成年时期海马区神经元的形态学改变;Western Blot检测大鼠海马区NMDA受体亚基NR2A、NR2B及其锚定蛋白PSD-95的表达;研究和探讨围麻醉期三碘甲状腺原氨酸(T3)的使用能否减轻七氟醚对新生大鼠大脑的神经毒性作用及其机制。 方法: 雌性SD大鼠处鼠5只，体重约180～220 g，成年雄性SD大鼠2只，雌鼠成功交配后自然分娩，待新生鼠出生后7 d(P7)进行实验。每只母鼠的子鼠随机分为生理盐水(NS)组，七氟醚(SEV)组和T3组，组内雌雄各半。NS组腹腔注射5 ml/kg生理盐水（与T3组等体积/体重比），SEV组于麻醉前0.5 h腹腔注射5 ml/kg生理盐水，T3组麻醉前0.5 h腹腔注射T3100μg/kg，每组均连续注射3d，每次间隔24 h。首次给药0.5 h后将SEV组和T3组新生鼠放入自制的22 cm×13cm×12 cm透明有机玻璃箱内，箱底铺钠石灰，箱内持续给予1 L/min流量的七氟醚与空气的混合气体，出口处连接麻醉气体监测仪确保箱内七氟醚的浓度维持在2％左右，持续麻醉6h后结束。NS组同样的装置给予1 L/min流量的空气6h。整个箱子放在恒温板上，温度37.0～38.0℃。且监测新生鼠呼吸、皮肤及口唇黏膜颜色，整个过程无呼吸抑制等异常情况发生。待麻醉结束后6h各组随机取3只新生鼠，断头取脑后制备石蜡切片，后行TUNEL染色计算DG区和SVZ区TUNEL阳性细胞密度。另麻醉结束后当天每组随机取5只新生鼠腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，连续注射7d后断头取脑行免疫荧光染色计算DG区BrdU与DCX、GFAP双标个数与BrdU单标的比例。余饲养至21d时断奶，继续饲养至25 d进行行为学实验。将各组大鼠随机分为两批，第一批进行WMT和EPMT。第二批进行OFT和SPT。第一批大鼠，每组随机取13只大鼠进行连续3天WMT，休息1天后进行EPMT。第二批大鼠从P25开始进行连续3天OFT，P28开始连续三天进行SPT。行为学结束后，每组随机取5只大鼠(1～2只/母鼠)过量麻醉处死，取大脑组织固定后制备冰冻切片行Nissl染色观察海马CA1及CA3区神经细胞密度;每组随机取3只大鼠过量麻醉后，快速取大脑行高尔基银染色，分别观察海马CA1、CA3区锥体细胞超微结构（树突分支数目、树突总长度以及空间分布）;在麻醉结束后6 h(P7)、P15、P30，各组随机取5只（1只/母鼠）大鼠的脑组织在冰面上快速分离，获得海马区组织行Western Blot检测NR2A、NR2B，及其锚定蛋白PSD-95蛋白表达情况。 结果: 1.所有七氟醚吸入麻醉的新生鼠麻醉及苏醒过程平稳，无呼吸抑制等异常情况出现，给药后的9天内，体重变化趋势组间无显著性差异(P＞0.05)。SEV组和T3组各有一只体重偏低的子鼠（分别为21 g，23 g）不再参与后继的实验。 2.麻醉结束后6h，与NS组相比较，SEV组DG区、SVZ区TUNEL阳性细胞密度均显著增加，差异有统计学意义，P＜0.01及P＜0.05)，而T3组与NS组比较，DG区和SVZ区的TUNEL阳性细胞密度均无统计学差异（P＞0.05）。P15时，SEV组子鼠DG区BrdU/DCX、BrdU/GFAP双标的阳性细胞数目与BrdU阳性细胞数目的比值均低于对照组(P＜0.05)，T3组BrdU/GFAP双标细胞个数与BrdU阳性细胞数目的比值高于SEV组(P＜0.05)，T3组与NS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。七氟醚可减少大脑中神经干细胞的增殖，而T3可以降低七氟醚对神经干细胞增殖的影响。 3.P25～P30，SEV组大鼠表现为学习记忆能力的减退，以及一定程度的抑郁和焦虑样情绪改变，与SEV组比较，T3组大鼠的焦虑和抑郁样情绪以及学习能力均有明显改善。具体表现为:和NS及T3组相比，SEV组大鼠水迷宫的逃避潜伏期显著延长（P＜0.01及P＜0.05），NS组和T3组相比较逃避潜伏期差异无统计学意义(P＞0.05);在SPT中，SEV组糖水饮用率较NS组显著降低(P＜0.01)，而T3组与NS组糖水饮用率相比较差异无统计学意义(P＞0.05)。P25～P27时，OFT中，SEV组大鼠在中央格区的停留时间较其他两组显著延长(P＜0.05)，T3组在中央格区的停留时间与NS组比较，无统计学差异（P＞0.05）。P30时，EPMT中，三组大鼠在开放臂（open arms）停留的时间，组间比较均无显著性差异(P＞0.05)。这些行为学结果表明，新生鼠七氟醚麻醉可致其成年期的学习记忆功能损害，并在一定程度上有焦虑和抑郁样复杂情绪表现，T3在围麻醉期的应用可以改善七氟醚对新生大鼠成年期学习记忆能力的损害和情绪的影响。 4.P30时，SEV组在CA3区细胞密度显著低于NS组及T3组（P＜0.01），NS组及T3组相比较差异无统计学意义(P＞0.05);而CA1区神经细胞密度，三组间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。P30时，SEV组和T3组海马CA3区锥体神经元树突总长度均显著短于NS组(P＜0.001，P＜0.05)，且SEV组在CA3区的锥体神经元树突分支数目较对照组显著减少(P＜0.01)，而T3组与NS组树突分支数比较，差异无统计学意义(P＞0.05);在CA1区，SEV组锥体神经元的树突总长度较NS组显著减少(P＜0.05)，T3组与NS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但CA1区锥体神经元树突分支数目，三组间比较均无统计学差异(P＞0.05)。该数据表明，七氟醚对新生大鼠海马区神经元的发育有损害作用，可导致CA1和CA3区锥体神经元不同程度的发育障碍，而T3在围麻醉期的使用可以减轻其对海马锥体神经元的毒性作用。 结论: 幼鼠在新生时期，七氟醚麻醉可导致中枢神经损伤，出现海马区神经细胞凋亡增多，影响海马DG区的细胞增殖，主要是新生的未成熟神经元和星形胶质细胞的增殖;大鼠成年期海马CA3区神经细胞减少，CA1及CA3区锥体神经元发育障碍;成年后的神经行为学出现异常，表现为焦虑和抑郁的复杂情绪表现及学习记忆能力损害。围麻醉期T3的使用可以减少神经细胞的凋亡，减轻成年期海马CA3区神经细胞的缺失，改善锥体神经元的发育。其机制可能与T3改善麻醉期间大脑细胞的能量代谢，使凋亡细胞减少，促进神经干细胞的增殖以及调节NMDA受体亚基NR2A/NR2B的水平，增加其锚定蛋白PDS-95的表达，改善海马神经元发育有关。
七氟醚;神经毒性;认知功能;三碘甲腺原氨酸
南方医科大学
硕士
麻醉学
李传翔
2016
中文
R971.2
73
2017-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）