拟南芥START基因家族At4g14500和At3g23080基因的功能及作用机制分析
START结构域大约含200个氨基酸序列，在拟南芥、水稻、动物、原生生物及细菌中都广泛存在含有编码START保守结构域的基因。拟南芥能编码START结构域蛋白的基因共有35个，其中有10个基因所编码的蛋白质仅含START结构域，其他家族成员除含START结构域外还含有其他结构域（如HD-ZLZ、HD-ZIP等），且仅含START结构域的成员与其他成员（START+其他结构域）亲缘关系较远，而与动物和人的START家族成员亲缘关系较近，因此研究At4g14500和At3g23080的生物学功能及作用机制，对明确START结构域的功能及其在生物进化中的地位具有重要理论价值。 生物信息学分析表明，At4g14500位于第4条染色体上，编码的蛋白质共含有433个氨基酸，At3g23080位于第3条染色体上，编码的蛋白质共含有419个氨基酸，均含有一个START_STARD2_7-like结构域，结构域内有磷脂酸胆碱的结合位点。但At4g14500编码的蛋白质具有两个跨膜的片段，而At3g23080具有1个跨膜的片段。组织定位结果表明，At4g14500主要定位在成熟拟南芥幼苗的莲座叶基部、莲座叶主叶脉、叶柄、茎及花瓣中;At3g23080主要在成熟的莲座叶片表达（表皮毛、叶柄除外），茎生叶的边缘和顶端、根的基部及萼片有少量表达，而且成熟的茎生叶和萼片的表达量多于幼嫩的茎生叶和萼片。利用Real time PCR技术分析At4g14500和At3g23080在拟南芥生长的不同时期的表达量，结果表明，At4g14500和At3g23080均在拟南芥发育21d时表达量最高，在幼嫩和衰老时期表达量最低，和组织定位结果一致。亚细胞定位结果表明，At4g14500和At3g23080编码的蛋白质均定位在细胞质膜上。这与生物信息学分析二者均有跨膜片段的结论相互印证。 At4g14500和At3g23080参与调控拟南芥的抽薹开花过程。与野生型拟南芥相比，At4g14500和At3g23080的T-DNA插入突变体均表现为抽薹时间提前4d以上，说明At4g14500和At3g23080在调控拟南芥开花方面起负调控作用。为研究其调控拟南芥开花的分子机制，本研究利用Real Time PCR的方法分析At4g14500和At3g23080对调控开花的关键基因SPY、FLC、GI、FT、LFY、CO的表达量的影响，在At4g14500T-DNA插入突变体中抑制开花的SPY和FLC基因的表达量受到明显抑制，而促进开花的的GI、FT、CO基因的表达量提高，LFY的表达量无明显变化;At3g23080T-DNA插入突变体中SPY和FLC的表达量也下降，FT、CO的表达量提高，GI、LFY的表达量无明显变化。说明At4g14500和At3g23080通过调控上述基因参与调控拟南芥的抽薹开花过程。 由于START结构域内具有磷脂酰胆碱结合位点，磷脂酰胆碱是细胞膜的主要成分，因此START结构域可能影响细胞膜的稳定性，参与调控拟南芥的抗逆反应。据此，本实验分析了At4g14500和At3g23080T-DNA插入突变体的抗逆性（盐、干旱、冷、热）。研究发现，在渗透胁迫（175mM NaCl和400mM甘露醇处理）下，At4g14500和At3g23080T-DNA插入突变体的种子萌发均受到轻微抑制，但幼苗耐渗透胁迫能力增强。在热和冷胁迫（45℃和4℃）条件下，At4g14500和At3g23080T-DNA插入突变体抗热和冷的能力高于野生型拟南芥。 为明确At4g14500和At3g23080调控拟南芥抗渗透胁迫能力的分子机制，本研究分析了At4g14500和At3g23080对拟南芥盐诱导关键基因SOS1、SOS2、SOS3、NHXI和甘露醇胁迫关键基因NCED、CIPK3表达量的影响。发现At4g14500的T-DNA插入突变体中SOS2、SOS3、NHXI、NCED、CIPK3的表达量上升，At3g23080的T-DNA插入突变体中SOS1、SOS2、SOS3、NHXI、NCED、CIPK3的表达量上升，说明At4g14500和At3g23080可通过调控上述基因的表达调控拟南芥的耐渗透胁迫能力。 为明确At4g14500和At3g23080调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制，本研究分析了At4g14500和At3g23080对拟南芥热诱导关键基因Hsf1a、HsfA1b、HsfA1d、HsfA1e、sfA2、HsfB2b和冷胁迫关键基因P5CS1、CBF1、CBF2、CBF3、RD29A表达量的影响。结果表明，At4g14500表达量降低后明显诱导HsfA1b、HsfB2b、CBF1、CBF3、RD29A的表达量，而At3g23080表达量降低后明显诱导HsfA1e、HsfA2、HsfB2b、P5CS1、CBF1、CBF2、CBF3、RD29A的表达量，为揭示At4g14500和At3g23080调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制提供了理论基础。 另外，构建了At4g14500及At3g23080基因过表达载体和原核表达载体，为进一步分析其功能打下基础。 综上所述，本论文明确了At4g14500和At3g23080的时空表达特性;确定了其参与拟南芥种子萌发、抽苔开花和逆境调控的功能;分析了At4g14500和At3g23080对开花、盐、干旱、冷、热信号转导途径关键基因表达量的影响，对深入分析At4g14500和At3g23080调控拟南芥生长发育的作用机理具有重要的意义。
植物生理;生长发育;基因家族;生物学功能
河北农业大学
硕士
植物学
王凤茹;董金皋
2016
中文
Q945
87
2017-02-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）