木质素β-O-4键酶解及酶与木质素吸附作用的研究
木质素是由三种单体通过C-C键与C-O键连接聚合而成，是一种含量丰富、结构复杂的天然支链型芳香族聚合物，其被视为许多高价值的芳香族化合物的潜在替代品。由于木质素中的β-醚键数量最为丰富，所以通过Sphingobium sp.strain SYK-6中以NAD+为辅酶的Cα-脱氢酶(LigD)、以谷胱甘肽为辅酶的β-醚酶(LigF)与谷胱甘肽裂合酶(LigG)断裂β-O-4键成为木质素降解中的研究热点。本研究中同时利用还原酶AVR对LigDFG酶解体系中的较为昂贵的辅酶NAD+与GSH进行循环再利用。本研究中我们利用酶解体系LigDFG+AVR尝试降解天然木质素样品，并且对木质素降解酶LigD、LigF与木质素之间的吸附机制进行研究。 1、本研究中将基因ligD、ligF、ligG、AVR克隆至大肠杆菌并重组表达纯化，通过优化诱导条件(16℃，IPTG终浓度0.5mmol·L-1，诱导12h)得到可溶性表达的LigD、LigF、LigG、AVR四种酶，纯度都达到95％以上。利用模型化合物GGE通过高效液相色谱(HPLC)与薄层层析验证了它们具有较高的体外活性。 2、利用酶解体系尝试降解利用膜分离、有氧氧化的手段得到重均分子量分别为24482Da、1627Da、859Da、725Da、679Da等的木质素磺酸盐样品及β-O-4键Cα位羟基被氧化的木质素样品，利用凝胶渗透色谱(GPC)、高效液相色谱(HPLC)及电喷雾质谱(ESI-MS)等分析手段证明该酶解体系对天然木质素有一定的降解趋势，但是酶解效率很低。建立了针对LigF酶解活性的快速检测方法——比色法与荧光测定法，并进行了综合比对。荧光定量法精确度高出至少1000倍，而比色法操作简便。 3、通过表面等离子体共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、高效液相色谱(HPLC)对木质素降解酶LigD、LigF与木质素磺酸盐之间的吸附机制进行分析研究，发现木质素能够抑制LigF的活性(MPHPV转化率由99.5％下降至32.6％)，对LigD影响较小(GGE转化率由41.7％变为41％);分子量较大的木质素片段对酶的抑制作用明显，分子量较小的木质素片段对酶的抑制作用不明显;疏水相互作用与静电相互作用在吸附中起到重要作用。
木质素;β-醚键;降解酶;吸附作用
北京化工大学
硕士
药学
王文雅
2016
中文
TQ353.6
100
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）